Чтобы понять, что же такое флуоресцентная микроскопия и принцип проведения исследований с ее помощью, нужно разобраться, как работают люминесцентные микроскопы.

Люминесцентные микроскопы работают, используя возможности естественного свечения клеток биологических организмов. Такие микроскопы способны заставить светится исследуемый объект посредством совместной работы двух светофильтров: возбуждающего и запирающего.

Возбуждающий светофильтр провоцирует свечение исследуемого объекта, а запирающий, в свою очередь, блокирует возбуждающий, оставляя только естественное или же люминесцентное свечение определенной исследуемой клетки.

Итак, можем сделать вывод, что флуоресцентная микроскопия — это исследование структуры клеток, на основе использования их естественного (природного) свечения.

Первый люминесцентный микроскоп был создан в 1911 году . Возможность его использования была доказана ученым А. Келлером. Известно также, что впервые использовал данное изобретение для проведения научных исследований русский ученый М. Цвет, который показал миру флуоресцентные возможности свечения хлорофилла в клетках растений.

В наше время люминесцентные микроскопы активно используются в таких научных сферах, как:

• микробиология;
• вирусология;
• гематология;
• цитодиагностика;
• цитогенетика.

В медицине флуоресцентная микроскопия используется для исследований разного рода грибковых заболеваний, к которым относится кандидоз, вызванный грибами CandidaAlbicans.

Как уже говорилось выше, флуоресцентная микроскопия активно используется в медицине, в частности, в гинекологии . Люминесцентные микроскопы способны с высокой точностью выявить вредоносные колонии грибков, которые доставляют пациенткам немало дискомфорта.

Люминесценцию также используют, чтобы обнаружить:

• кислотоустойчивые микобактерии;
• возбудителей и .

Исследовать такие образцы, как, к примеру, витамины А и В2, а также хлорофилл стоит как можно быстрее, поскольку от влияния на них УФ-излучением, они могут потерять свои люминесцентные способности.

Пожалуй, единственным минусом флуоресцентной микроскопии является покупка самого оборудования для исследований, а также высокая стоимость расходных материалов . Кроме того, чтобы проводить исследования на люминесцентном оборудовании необходимо дополнительное обучение сотрудников лаборатории.

Лампы на флуоресцентном микроскопе очень чувствительны, быстро изнашиваются, их следует регулярно осматривать на предмет поломок и заменять. Малейшее колебание напряжения электричества может вывести такой микроскоп из строя.

Флуоресцентный микроскоп – система строящаяся на базе прямого или инвертированного микроскопа проходящего света с добавлением флуоресцентного модуля отраженного света. Флуоресцентные микроскопы универсальны, в большинстве случаев могут быть использованы как микроскопы для работы в видимом проходящем свете. В статье рассмотрены основы формирования флуоресцентного изображения, конструкция флуоресцентных микроскопов, объективы для флуоресценции и специальные высокочувствительные камеры.

Флуоресцентная микроскопия. Основы формирования флуоресцентного изображения.

Флуоресценция – физическое явление, заключающееся в поглощении кванта света веществом, способным флуоресцировать (флуорофором), с последующим быстрым испусканем другого кванта, со свойствами, отличными от исходного. По сути явление флуоресенции представляет из себя переход электронов по энергетическим уровням вещества. Энергия, получаемая атомом вещества при облучении делится на две части. Меньшая расходуется на релаксацию, а большая уходит на излучение фотона определенной энергии. Спектр флуоресценции сдвинут относительно спектра поглощения в сторону длинных волн.

Это явление получило название «Стоксов сдвиг». Его причиной являются безызлучательные релаксационные процессы. В результате часть энергии поглощенного фотона теряется, а испускаемый фотон имеет меньшую энергию, и, соответственно, большую длину волны. Рассмотрим, каким образом испускание и поглощение света реализовано во флуоресцентном микроскопе.

Флуоресцентный микроскоп. Ход лучей при флуоресцентных исследованиях. Конструкция флуоресцентных фильтр-блоков.

Флуоресцентный микроскоп строится на базе прямого или инвертированного лабораторного микроскопа добавлением флуоресцентных модулей: осветителя отраженного света, туррели флуоресцентных фильтр-кубов, специального источника света, и, опционально, план полу апохроматическими объективами (флуотарами), с расширенной спектральной пропускной характеристикой.

Флуоресцентный микроскоп обладает следующим ходом лучей. На рисунке приведена схема прямого микроскопа, в инвертированном микроскопе схема полностью аналогична, только зеркально отражена сверху вниз.

Ход лучей прямого флуоресцентного микроскопа

Из спектра, испускаемого флуоресцентным источником света, вырезается полоса возбуждения необходимой ширины. (На примере это синее возбуждение, около 450 нм). Возбуждающий луч отражается от дихроичного зеркала и попадает на образец через объектив. Дихроичное зеркало отражает лучи до определенной длины волны (в данном случае до 460 нм), и пропускает лучи с большей длинной волны. В образце флуорофоры поглощают возбуждающий синий свет, и испускают более длинноволновое излучение. Флуоресцентное свечение беспрепятственно проходит через дихроичное зеркало, а барьерный фильтр вырезает нам необходимый для изучения спектр. Его необходимость заключается в том, что иногда флуоресцентное свечение находится в очень широком диапазоне длин волн, что мешает исследователю установить природу и свойства интересующего образца.

Флуоресцентный фильтр блок – устройство, объединяющее в себе дихроичное зеркало и два фильтра. Обычно в флуоресцентный микроскоп устанавливается несколько фильтров, способных возбуждать флуоресценцию в различном спектре. В зависимости от флуоресцентных меток или красителей, нанесенных на образец, картина в каждом канале будет отличной. Ядерный материал клетки будет наблюдаться в одном канале, митохондрии в другом, а цитоплазма в третьем. Ни один метод контрастирования не может дать такое радикальное деление образца с малым контрастом.

На рисунке изображен флуоресцентный фильтр блок (часто встречается название флуоресцентный куб) U-MWB2, производства компании Olympus, и его спектральная характеристика. Возбуждение 460-490 нм, дихроик 500 нм и эмиссия (или барьерный фильтр) 520+ нм. Это означает, что фильтр широкополосный, и позволяет наблюдать одновременно различный окрас разных флуоресцентных меток.

Осветители для флуоресцентной микроскопии.

Флуоресцентный осветитель должен обладать самым главным свойством: высокая пиковая мощность в каждой интересующей нас зоне спектра, включая ультрафиолет. Распространенными флуоресцентными источниками являются ртутные дуговые лампы HBO, металлогалоидные лампы, ксеноновые источники, лазеры и светодиоды. Рассмотрим подробно преимущества и недостатки источников

Ртутные лампы HBO

Самым распространенным осветителем является ртутная лампа HBO. Она используется как в рутинных лабораторных микроскопах, так и в высококачественных исследовательских системах. Это очень удобный и относительно недорогой осветитель, обладающий высокой мощностью.

К недостаткам можно отнести лишь необходимость центровки лампы при установке для отдачи полной мощности, а также относительно короткий срок службы – от 100 до 300 часов в зависимости от модели. После этого срока спектр лампы меняется, уровень мощности падает. Лампу всегда необходимо менять точно в срок.

Ртутные флуоресцентные лампы HBO представлены в нашем каталоге. При установке лампы требуется юстировка оптической системы лампового домика, а также настройка положения лампы. Мы выполняем все необходимые работы по замене лампы, настройке микроскопа и сервисному обслуживанию, но вы можете заменить лампу самостоятельно, предварительно изучив инструкцию.

В последнее время, металлогалоидные флуоресцентные осветители устанавливаются на микроскоп все чаще, срок службы в 2000 часов, отсутствие необходимости юстировки, хорошие спектральные характеристики – все это помогает исследователям решать задачи быстрее. Что касается стоимости, то, конечно, такой источник стоит гораздо дороже ртутных ламп HBO.

Светодиодные флуоресцентные источники

Светодиодные источники света – самое перспективное направление из новых технологий в микроскопии. Эти универсальные полупроводниковые осветители обладают всеми функциями ламп накаливания и газоразрядных ламп, имея при этом возможность работать от батареек, а также низковольтных и недорогих импульсных блоков питания.

Обладают меньшей мощностью чем ртутные и металлогалоидные осветители. Широко применяются в рутинных микроскопах, к примеру микроскоп для исследования туберкулеза Zeiss Primo Star iLed.

Лазеры.

Камеры для флуоресцентных микроскопов. Мультиканальная флуоресценция.

Камеры для флуоресцентной микроскопии должны быть высокочувствительными и обладать достаточным разрешением для работы на объективах от 20х до 100х (обычно от 1 до 5 мегапикселей). Про необходимое разрешение микроскопных камер вы можете прочитать в соответствующей .

Чувствительность камеры, высокое соотношение сигнал/шум, хорошее охлаждение – первое на что стоит обращать внимание при выборе камеры для установки на флуоресцентный микроскоп.

Флуоресцентные камеры черно-белые. Красочные флуоресцентные картинки получаются окрашиванием изображения в отдельных каналах в так называемые псевдоцвета. Это происходит в графическом редакторе, или в специальном программном обеспечении, решающем вопросы мультиканальной флуоресценции – объединения флуоресцентных изображений нескольких каналов в одно итоговое. Рассмотрим мультиканальную флуоресценцию на примере изображения кортикальных нейронов. Итоговое изображение сформировано из двух каналов. Изначальные фотографии черно-белые, мы присвоили им псевдоцвета, раскрасив их в синий и зеленый цвет. Обычно цвета выбираются исходя из близости к реальному флуоресцентному свечению получаемому на образце, но это не обязательно. Главное, мы можем детально изучить ядерный материал (синий канал) и дендриты (зеленый). Такой контрастной картины не удалось бы получить без флуоресцентной микроскопии.

) — метод детектирования флуоресцентных микрообъектов с помощью светового (оптического) микроскопа. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях.

Описание

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и , метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с или . Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причем не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Флуоресцентный микроскоп состоит из источника света, возбуждающего флуорофор; детектора, регистрирующего излучение флуорофора; оптической системы, которая обеспечивает фокусировку света и увеличение объекта. Согласно классическим работам Э. Аббе, разрешение оптической системы, построенной на использовании линз, ограничено свойством дифракции света. Предельное расстояние, на котором могут быть различены два объекта (d ), определяется длиной волны света , угловой апертурой объектива и показателем преломления среды n :

Поскольку обычно n < 1,56, < 70 o , а длина волны используемого излучения находится в диапазоне 350–600 нм, то лучшее разрешение традиционных составляет более 200 нм в фокусной плоскости и более 450 нм вдоль оптической оси.

Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX-го и XXI-го веков привело к развитию новых методов - и , а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного нано-разрешения ().

Автор

• Борисенко Григорий Геннадиевич

Источники

1. Kässens M. et al. Basics of Light Microscopy & Imaging. - GIT Verlag GmbH & Co. KG, 2006. - 52 p.
2. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung // Arch. Mikrosc. Anat. Entwicklungsmech. 1873. Bd. 9. S. 413–468.

Флуоресцентная микроскопия (англ. fluorescence microscopy ) - метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях.

Описание

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с электронной или атомно-силовой микроскопией . Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причем не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Во флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой , а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флюоресцентного препарата может быть сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут.

Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX-го и XXI-го веков привело к развитию новых методов - двухфотонной и конфокальной микроскопии, а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного нано-разрешения.

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия - метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца. Простейший метод, с помощью которого можно исследовать поверхность, называют эпифлуоресцентной микроскопией.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

Метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) основан на явлении отражения электромагнитных волн от границы раздела двух прозрачных сред, которое возникает при условии, что волна падает из среды с более высоким показателем преломления под углом, превышающем критический (1/n). Интенсивность излучения, проникающего во вторую среду затухает по экспоненциальному закону, что позволяет детектировать флуоресцентные объекты, возбуждаемые этим излучением, в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм . Таким образом, TIRFM может по праву считаться одним из методов флуоресцентной наноскопии. В биологии метод используется для визуализации плазматической мембраны и примембранных структур клеток.

Флуоресцентная наноскопия

В последние годы было разработано несколько новых подходов в области флуоресцентной микроскопии, которые позволили преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного разрешения ~10 нм. Эти методы стали объединять общим термином флуоресцентная наноскопия.

Системы флуоресцентной наноскопии построены на трёх принципиально различающихся подходах:

• улучшение фокусировки за счёт создания новых оптических схем и применения объективов с высокой угловой апертурой (4Pi, I5M и I5S микроскопия);
• использование явления полного внутреннего отражения (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM);
• контролируемое «включение» и «выключение» флуоресцентных молекул и последовательное их детектирование (STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Можно предвидеть несколько приложений флуоресцентных наноскопических методов в биологии и медицине. Наноскопия позволяет напрямую изучать взаимодействия между белками , ДНК и РНК , и, следовательно, может сыграть существенную роль в развитии геномики и протеомики , в изучении физиологии клетки, в понимании патофизиолоических механизмов, связанных с нарушением образования сложных белковых комплексов и т. п.

• 4Pi и I5M реализованы на основе двухобъективной системы, которая позволяет улучшить разрешение вдоль оптической оси до 80 нм благодаря суммированию в фокальной точке двух встречных сферических фронтов света. I5S обладает улучшенным разрешением и в фокусной плоскости (до 100 нм).
• TIRFM позволяет детектировать флуоресцентные объекты в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм.
• STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT. Поглощение кванта света молекулой сопровождается переходом электрона с основного энергетического уровня (S 0) на возбужденный флуоресцентный уровень (синглетный S 1 или триплетный T 1). Поглощение также может индуцировать обратимые внутримолекулярные перестройки (например, цис-транс изомеризацию), в результате которых происходит изменение спектра флуоресценции . Любой из переходов S 0 →S 1 , S 0 →T 1 может быть использован для включения/выключения флуорофоров и увеличения разрешения.

См. также

Напишите отзыв о статье "Флуоресцентная микроскопия"

Примечания

Литература

• Kässens M. et al. Basics of Light Microscopy & Imaging. - GIT Verlag GmbH & Co. KG, 2006. - 52 p.
• Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung // Arch. Mikrosc. Anat. Entwicklungsmech. 1873. Bd. 9. S. 413–468.
• Truskey, G.A., Burmeister, J.S., Grapa, E. el al. Journal of Cell Science Volume 103, Issue 2, 1992, P. 491–499.
• Axelrod, D. Journal of Biomedical Optics Volume 6, Issue 1, January 2001, Pages 6–13.
• Hell S.W. Far-Field Optical Nanoscopy // Science. 2007. V. 316. P. 1153–1158.

Ссылки

При написании этой статьи использовался материал из издания «Словарь нанотехнологических терминов Creative Commons

При написании этой статьи использовался материал из издания «Словарь нанотехнологических терминов » (2009-…), доступного по лицензии Creative Commons .

При написании этой статьи использовался материал из издания «Словарь нанотехнологических терминов » (2009-…), доступного по лицензии Creative Commons .

• (англ.)

Отрывок, характеризующий Флуоресцентная микроскопия

– Хватит пустых разговоров! – вдруг, довольно потирая руки, воскликнул «святой отец». – Пройдёмте со мной, моя дорогая, я думаю, на этот раз мне всё же удастся Вас ошеломить!..
Если бы он только знал, как хорошо это ему постоянно удавалось!.. Моё сердце заныло, предчувствуя недоброе. Но выбора не было – приходилось идти...

Довольно улыбаясь, Караффа буквально «тащил» меня за руку по длинному коридору, пока мы наконец-то не остановились у тяжёлой, украшенной узорчатой позолотой, двери. Он повернул ручку и... О, боги!!!.. Я оказалась в своей любимой венецианской комнате, в нашем родном фамильном палаццо...
Потрясённо озираясь вокруг, не в состоянии придти в себя от так неожиданно обрушившегося «сюрприза», я успокаивала своё выскакивающее сердце, будучи не в состоянии вздохнуть!.. Всё вокруг кружилось тысячами воспоминаний, безжалостно окуная меня в давно прожитые, и уже частично забытые, чудесные годы, тогда ещё не загубленные злостью жестокого человека... воссоздавшего для чего-то здесь(!) сегодня мой родной, но давно утерянный, счастливый мир... В этой, чудом «воскресшей», комнате присутствовала каждая дорогая мне моя личная вещь, каждая любимая мною мелочь!.. Не в состоянии отвести глаз от всей этой милой и такой привычной для меня обстановки, я боялась пошевелиться, чтобы нечаянно не спугнуть дивное видение...
– Нравится ли вам мой сюрприз, мадонна? – довольный произведённым эффектом, спросил Караффа.
Самое невероятное было то, что этот странный человек совершенно искренне не понимал, какую глубокую душевную боль он причинил мне своим «сюрпризом»!.. Видя ЗДЕСЬ (!!!) то, что когда-то было настоящим «очагом» моего семейного счастья и покоя, мне хотелось лишь одного – кинуться на этого жуткого «святого» Папу и душить его в смертельном объятии, пока из него не улетит навсегда его ужасающая чёрная душа... Но вместо того, чтобы осуществить так сильно мною желаемое, я лишь попыталась собраться, чтобы Караффа не услышал, как дрожит мой голос, и как можно спокойнее произнесла:
– Простите, ваше святейшество, могу ли я на какое-то время остаться здесь одна?
– Ну, конечно же, Изидора! Это теперь ваши покои! Надеюсь, они вам нравятся.
Неужели же он и в правду не понимал, что творил?!.. Или наоборот – прекрасно знал?.. И это всего лишь «веселилось» его неугомонное зверство, которое всё ещё не находило покоя, выдумывая для меня какие-то новые пытки?!.. Вдруг меня полоснула жгучая мысль – а что же, в таком случае, стало со всем остальным?.. Что стало с нашим чудесным домом, который мы все так сильно любили? Что стало со слугами и челядью, со всеми людьми, которые там жили?!.
– Могу ли я спросить ваше святейшество, что стало с нашим родовым дворцом в Венеции?– севшим от волнения голосом прошептала я. – Что стало с теми, кто там жил?.. Вы ведь не выбросили людей на улицу, я надеюсь? У них ведь нет другого дома, святейшество!..
Караффа недовольно поморщился.
– Помилуйте, Изидора! О них ли вам стоит сейчас заботиться?.. Ваш дом, как вы, конечно же, понимаете, теперь стал собственностью нашей святейшей церкви. И всё, что с ним было связано – более уже не является Вашей заботой!
– Мой дом, как и всё то, что находится внутри него, Ваше святейшество, после смерти моего горячо любимого мужа, Джироламо, принадлежит моей дочери Анне, пока она жива! – возмущённо воскликнула я. – Или «святая» церковь уже не считает её жильцом на этом свете?!
Внутри у меня всё кипело, хотя я прекрасно понимала, что, злясь, я только усложняла своё и так уже безнадёжное, положение. Но бесцеремонность и наглость Караффы, я уверена, не могла бы оставить спокойным ни одного нормального человека! Даже тогда, когда речь шла всего лишь о поруганных, дорогих его сердцу воспоминаниях...
– Пока Анна будет жива, она будет находиться здесь, мадонна, и служить нашей любимой святейшей церкви! Ну, а если она, к своему несчастью, передумает – ей, так или иначе, уже не понадобится ваш чудесный дом! – в бешенстве прошипел Караффа. – Не переусердствуйте в своём рвении найти справедливость, Изидора! Оно может лишь навредить вам. Моё долготерпение тоже имеет границы... И я искренне не советую вам их переступать!..
Резко повернувшись, он исчез за дверью, даже не попрощавшись и не известив, как долго я могу оставаться одна в своём, так нежданно воскресшем, прошлом...
Время остановилось... безжалостно швырнув меня, с помощью больной фантазии Караффы, в мои счастливые, безоблачные дни, совсем не волнуясь о том, что от такой неожиданной «реальности» у меня просто могло остановиться сердце...
Я грустно опустилась на стул у знакомого зеркала, в котором так часто когда-то отражались любимые лица моих родных... И у которого теперь, окружённая дорогими призраками, я сидела совсем одна... Воспоминания душили силой своей красоты и глубоко казнили горькой печалью нашего ушедшего счастья...
Когда-то (теперь казалось – очень давно!) у этого же огромного зеркала я каждое утро причёсывала чудесные, шёлковистые волосы моей маленькой Анны, шутливо давая ей первые детские уроки «ведьминой» школы... В этом же зеркале отражались горящие любовью глаза Джироламо, ласково обнимавшего меня за плечи... Это зеркало отражало в себе тысячи бережно хранимых, дивных мгновений, всколыхнувших теперь до самой глубины мою израненную, измученную душу.
Здесь же рядом, на маленьком ночном столике, стояла чудесная малахитовая шкатулка, в которой покоились мои великолепные украшения, так щедро когда-то подаренные мне моим добрым мужем, и вызывавшие дикую зависть богатых и капризных венецианок в те далёкие, прошедшие дни... Только вот сегодня эта шкатулка пустовала... Чьи-то грязные, жадные руки успели «убрать» подальше все, хранившееся там «блестящие безделушки», оценив в них только лишь денежную стоимость каждой отдельной вещи... Для меня же это была моя память, это были дни моего чистого счастья: вечер моей свадьбы... рождение Анны... какие-то мои, уже давно забытые победы или события нашей совместной жизни, каждое из которых отмечалось новым произведением искусства, право на которое имела лишь я одна... Это были не просто «камни», которые стоили дорого, это была забота моего Джироламо, его желание вызвать мою улыбку, и его восхищение моей красотой, которой он так искренне и глубоко гордился, и так честно и горячо любил... И вот теперь этих чистых воспоминаний касались чьи-то похотливые, жадные пальцы, на которых, съёжившись, горько плакала наша поруганная любовь...