Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов - шифф-йодная кислота).

Метод Шабадаша

Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.

Посуда и оборудование

• Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.
• Мерные цилиндры.
• Градуированные пипетки.
• Колбы емкостью 250 мл.
• Воронки.
• Горелки.
• Термостат.
• Весы.

Реактивы

• 0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.
• Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).
• Сернистая вода: к 10 мл 10 % раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.
• Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.
• 1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).
• 0,1 % спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).

Ход окраски

• Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.
• Промывают в двух сменах дистиллированной воды.
• Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).
• Промывают в трех сменах дистиллированной воды.
• Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 - 2 мин).
• Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 - 40 мин (в темноте).
• Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.
• Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.
• Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.
• Промывают в дистиллированной воде.

Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.

В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.

Результат метода Шабадаша

Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.

Расчет количества гликогена производят по полуколичественному методу или выражают в процентах.

Кроме гликогена, положительную реакцию могут давать такие ШИК-положительные вещества, как кислые и нейтральные мукополисахариды, мукопротеины, гликопротеины и др. Гликоген легко дифференцировать от других веществ пробой со слюной или диастазой.

Проба со слюной

Препарат помещают в свежесобранную слюну и оставляют на 30 мин в термостате. Затем производят окраску на гликоген приведенным выше методом. Инкубация препаратов со слюной способствует расщеплению гликогена, и при реакции с реактивом Шиффа не получается розовой окраски.

Идентифицировать гликоген можно также путем предварительной инкубации мазков с амилазой (1 мл профильтрованной амилазы растворить в 40 мл физиологического раствора) в течение 30 мин в термостате.

На практике проба со слюной обычно не проводится, поэтому под PAS-положительным материалом понимаются, как правило, все полисахариды, а не только гликоген.

Нормальные величины метода Шабадаша

В мазках периферической крови гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов (в виде обильной мелкой зернистости), цитоплазме лимфоцитов (в виде небольшого количества крупных зерен) и тромбоцитах (в виде одиночных крупных зерен). В пунктате костного мозга гликоген выявляется в нейтрофилах разной степени зрелости, лимфоцитах и мегакариоцитах.

Концентрация PAS-положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобласты, промиелоциты, миелоциты) . В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. У здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов крови (+++) колеблется в пределах 2-12 %, средней интенсивности окраски (++) - в пределах 72-90%, слабо окрашенных (+) - от 4 до 18%. СЦК равен 1,71-2,04. Некоторые авторы приводят более высокие значения СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей (2,485 - 2,555). У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена (1,93 - 2,03).

В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал располагается следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.

В моноцитах гликоген чаще выявляется в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне светло-розового диффузного окрашивания.

В лимфоцитах крови здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 8,1 - 12,7% клеток. Некоторые авторы дают цифры от 2 до 30%.

В норме от 3 до 10% клеток эритроидного ряда содержат мукополисахариды.

В мегакариоцитах костного мозга гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30-50), напоминая скопления кровяных пластинок. У здоровых людей число гликогенположительных мегакариоцитов составляет 58,45 - 65,55 %. В тромбоцитах PAS-положительный материал выявляется в виде мелких рассеянных гранул по периферии клетки либо в виде интенсивного центрально расположенного пятна.

Клиническое значение метода Шабадаша

Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, эритремии, сахарном диабете, уменьшение - при агранулоцитозах, лучевой болезни, хроническом миелолейкозе, особенно при прогрессировании процесса.

Повышение числа гликогенположительных лимфоцитов (до 70 - 80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно хронического лимфолейкоза.

При хроническом миелолейкозе содержание гликогена в гранулоцитах уменьшается приблизительно в 2 раза по отношению к норме, хотя общее его количество, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышенным вследствие лейкоцитоза.

При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено, после спленэктомии оно повышается до нормальных величин.

При острых лейкозах гликоген можно обнаружить в бластных клетках: при остром миелобластном лейкозе в виде мелкой зернистости в цитоплазме или в виде слабого диффузного ее окрашивания, причем в части бластов PAS-реакция отрицательная. При остром промиелоцитарном лейкозе наблюдается яркое диффузное окрашивание цитоплазмы. В монобластах реакция может быть отрицательной, слабо положительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляется в виде рассеянных мелких или средних гранул, располагающихся по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). При эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах, в виде диффузного окрашивания разной интенсивности - в нормобластах. Лимфобласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, располагающихся венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки, на неокрашенном фоне. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.

Цитохимическое исследование на гликоген можно проводить не только в мазках крови и костного мозга. Так, например, можно исследовать мазки влагалищного эпителия и по результатам исследования судить о функциональном состоянии яичников. В норме у женщин обнаруживают много гликогена в клетках, в то время как обеднение их гликогеном свидетельствует о нарушении функции яичников.

В опухолях количество гликогена различно: зрелые доброкачественные опухоли содержат много гликогена, в незрелых раковых опухолях количество гликогена резко уменьшено. Снижение гликогена в опухолевых клетках, вероятно, может быть использовано как показатель злокачественности опухоли.

Микрофотографии ШИК-реакции:

Литература:

• Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.
• Справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.
• Л. В. Козловская, А. Ю. Николаев. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. Москва, Медицина, 1985 г.
• В.Г. Палагнюк - Цитохимическая диагностика острых лейкозов.
• Исследование системы крови в клинической практике. Под ред. Г. И. Козинца и В. А. Макарова. - М.: Триада-Х, 1997 г.

ШИК-реакция)

гистохимический метод выявления гликогена, нейтральных глико- и мукопротеидов, сиаломукопротеидов и гликолипидов, основанный на окислении перйодной кислотой (или ее солями) 1,2-гликольных групп, содержащихся в этих соединениях, до альдегидов, которые выявляют с помощью реактива Шиффа.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Смотреть что такое "Pas-реакция" в других словарях:

Schiff (PAS) reaction) тест, позволяющий выявить наличие в тканях гликопротеинов, полисахаридов, некоторых мукополисахаридов, гликолипидов и ряда жирных кислот. Исследуемая ткань после воздействия на нее реактива Шиффа обрабатывается йодной… … Медицинские термины

ШИК-РЕАКЦИЯ, PAS-РЕАКЦИЯ - (periodic acid Schiff (PAS) reaction) тест, позволяющий выявить наличие в тканях гликопротеинов, полисахаридов, некоторых мукополисахаридов, гликолипидов и ряда жирных кислот. Исследуемая ткань после воздействия на нее реактива Шиффа… … Толковый словарь по медицине

- (син. ШИК реакция) гистохимический метод выявления гликогена, нейтральных глико и мукопротеидов, сиаломукопротеидов и гликолипидов, основанный на окислении перйодной кислотой (или ее солями) 1,2 гликольных групп, содержащихся в этих соединениях,… … Большой медицинский словарь

См. Pas реакция … Большой медицинский словарь

Эта статья является частью серии: Конфликт в Западной Сахаре Западная Сахара Историческая справка История Западной Сахары История Марокко Сахарская Арабская Демократическая Республика Испанс … Википедия

I Пневмония (pneumonia; греч. pneumon легкое) инфекционное воспаление легочной ткани, поражающее все структуры легких с обязательным вовлечением альвеол. Неинфекционные воспалительные процессы в легочной ткани, возникающие под влиянием вредных… … Медицинская энциклопедия

См. Pas реакция … Медицинская энциклопедия

- (сосудисто стромальные диспротеинозы) дисметаболические (дистрофические) процессы, характеризующиеся преимущественным нарушением белкового обмена и первично развивающиеся в строме органов. Традиционно наряду с мезенхимальными диспротеинозами как… … Википедия

Пециломикоз это новая нозологическая единица микоза, введенная Baker в 1971 г. на основании имеющихся сообщений о поражении человека и животных грибами рода Paecilomyces. Остается до настоящего времени малоизученным видом системного… … Википедия

- — родился 26 мая 1799 г. в Москве, на Немецкой улице в доме Скворцова; умер 29 января 1837 г. в Петербурге. Со стороны отца Пушкин принадлежал к старинному дворянскому роду, происходившему, по сказанию родословных, от выходца "из… … Большая биографическая энциклопедия

Цитохимические методы преследуют отождествление химических и ферментных веществ в клетках, используя для этого цветные реакции. Цитохимические препараты сохраняют клеточную структуру, что допускает выявление клеток и внутриклеточную локализацию исследувмого составного. Вот почему в гематологии отдается предпочтение не биохимическим, трудоемким, разрушающим клеточную структуру о относящимся к весьма разнородной клеточной популяции, а цитохимическим способам.

Цитохимия доказала, что среди морфологически одинаковых клеток имеются существенные химические и ферментативные различия.

Гликоген (реакция ШИК) (PAS) - метод Гочкисс - Мак Минус

Принцип ШИК-реакции . Полисахариды выявляются путем реакции, окисляющей спиртные группы, которые преобразуются в альдегидные группы, и отождествления последних путем цветной реакции реагентом Шифф.

Реагенты для ШИК-реакции : 1. Закрепляющий смесь спирт-формалин: 9 частей абсолютного этилового спирта +1 часть 40% формалина; сохранять при температуре +4°.

2. Периодння кислота, 1% водный раствор. Раствор бесцветный. Хранить в бутылке из коричневого стекла, в темноте, при лабораторной температуре. Пожелтевший раствор неприменим.

3. Реагент Шиффа. Развести 1 г основного фуксина в 200 мл дистилированной воды при температуре кипения. Болтать 5 минут, охладить до температуры 50°, профильтровать и добавить 20 мл нормальной соляной кислоты. Охладить до 25°, добавить 2 г метабисульфита натрия или калия, которые полностью обеспечивают раствор. Раствор должен простоять сутки в условиях темноты и холода (+4°). Затем добавить 2 г активированного угля, поболтать 1 мин. и профильтровать.
Полученный фильтрат прозрачный и бесцветный. Допускается слегка желтоватый оттенок; если раствор розовеет, становится неприменимым. Хранить при температуре +4° в герметически закрытой бутылке из коричневого стекла.

4. Зеленый светлый -1% водный раствор.

5. Диастаз: неразжиженная слюна человека или 0,1% раствора амилолитического-диастатического фермента в физиологическом солевом растворе.

Техника проведения ШИК-реакции

1) 10-тиминутное закрепление мазков смесью спирт-формалин; промывание дистилированной водой;
2) окисление 1% раствором периодной кислоты, 10 мин.; промывание дистилированной водой;
3) окраска реагентом Шиффа в накрытой посуде, в условиях темноты и холода, в течение 2 часов; промывание проточной водой;
4) контрастная окраска 1% зеленым-светлым в течение 1 минуты; промывание проточной водой.

Контрольный закрепленный мазок подвергается инкубации диастазом, 60 мин. в условиях комнатной температуры для выборочного удаления гликогена. После промывания дистилированной водой подвергается обработке по обычному методу.

Оценка результатов ШИК-реакции

Гликоген , окрашенным в багряно красный- цвет, представляется в виде зерен или рассеянный. Для контроля реакции используются зрелые гранулоциты мазка. Помимо гликогена ШИК положительную реакцию дают и другие вещества углеводной природы, такие как, муцин, мукопротеины, цереброзиды, фибрин. Дифференциация гликогена от этих составных осуществляется путем предварительной обработки диастазом, после чего гликоген более не окрашивается.

В гранулоцитах гликоген находится в рассеянном виде уже на стадии промиелоцита и начинает увеличиваться по мере созревания. В нормальных условиях лимфоциты отрицательны или в 20% из них могут находиться несколько мелких зерен гликогена. Моноциты отрицательные либо имеют тонкую зернистость.

Интенсивность окраски определяется полуколичественно. В реакция ШИК отражается в виде гликогенного показателя, или среднего показателя реакции (Астальди). Нормальный показатель гликогена колеблется в пределах от 0,10 до 0,30. Обычно лишь у патологических лимфоцитов наблюдается степень нагрузки более 3.

Значилось метода ШИК-реакции :
а) При постановке дифференциального диагноза отдельных цитологических видов острой лейкемии:
- Миелобласты и промиелоуиты ШИК-отрицательные или приобретают слабую диффузную окраску. Тела Ауера дают положительную реакцию, которая ослабевает после переваривания со слюной.
- Лимфобласты при острой лейкемии и лимфосаркоме дают резкую ШИК-положительную реакцию в виде зерен или крупных блоков гликогена.
- Эритробласты при эритремии и острой эритролейкемии дают резко положительную рассеянную или зернистую реакцию, в противоположность нормальным эритробластам, которые ШИК-отрицательные;
- Моноцитоидные б ласты непостоянно слабо положительные, с тонкой зернистостью.

б) В целях постановки диагноза и наблюдения за эффективностью лечения при хронической лимфатической лейкемии: завышенный показатель гликогена указывает на тяжелую форму заболевания и тяжкий прогноз.
Рост гликогена в патологических лимфоцитах не характерное для лейкемии явление, оно объясняется ростом метаболической активности при любом виде лимфоидной пролиферации.

в) Для дифференциации клеток Гоше от иных макрофагов с накоплением.