В ядре ДНК всегда находится в комплексе с белками и упакована в той или иной степени в нуклеопротеиновые структуры.

В хромосомах ДНК (около 40% от всего хроматина) находится в комплексе с основными и кислыми белками, что обеспечивает многоступенчатую компактизацию молекулы ДНК. Первые уровни компактизации осуществляются при взаимодействии ДНК с основными белками - гистонами. Гистоны имеют повышенное содержание основных аминокислот - лизина и аргинина. Пять типов гистонов отличаются друг от друга относительным содержанием этих двух аминокислот. Гистоны Н3 и Н4 очень консервативны. Секвенирование гена гистона Н4 показало, что у теленка и гороха этот белок отличается всего двумя аминокислотами. Наиболее изменчивы гистоны Н2А и Н2В. Комплекс между ДНК и гистонами формирует нуклеосомную структуру хроматина. Пары молекул гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4 формируют гистоновый октамер клиновидной формы (рис. 1). Узкая часть образована тетрамером Н3-Н4, а широкая состоит из Н2А-Н2В. N-концевые части гистонов свободно расходятся в стороны. Участок ДНК в 146 пн связывается с октамером, делая 1,75 оборота вокруг него. Комплекс данного участка ДНК с гистоновым октамером называют нуклеосомой . Участок ДНК между соседними нуклеосомами называют линкерным (около 60 пн). Более 90% ДНК в клетке присутствует в виде нуклеосом, при этом длина нити ДНК уменьшается в 7 раз, а толщина сформированной нуклеопротеиновой нити составляет 10 нм.

Гистоны контактируют с фосфодиэфирным остовом молекулы ДНК. Существуют и гидрофобные взаимодействия с остатками рибозы. Азотистые основания во взаимодействии с гистонами не участвуют. Поэтому связывание ДНК с нуклеосомной глобулой не является специфичным в отношении нуклеотидной последовательности.

Рисунок 1. Строение нуклеосом

Гистон Н1 взаимодействует с обоими концами ДНК, входящей в состав нуклеосомы, в районе тетрамера Н3-Н4, т.е. Н1 как бы обозначает границы линкерной ДНК. В молекуле гистона Н1 можно выделить глобулярную сердцевину, N-конец и С-конец. Взаимодействие между N- и С-концами соседних молекул гистона Н1 обеспечивает сближение нуклеосом. При этом нуклеосомная нить сворачивается в спираль или образует зигзагообразную нить толщиной 30 нм, состоящую из сближенных нуклеосом - нуклеомеров. Каждая нуклеомера состоит из 8-10 нуклеосом.

Рисунок 2. Взаимодействие гистонов в составе нуклеосом

Исследования последних лет подтверждают зигзагообразную модель организации 30 нм фибриллы. В стабилизации этой фибриллы большую роль играют взаимодействия N-концевых доменов гистонов соседних нуклеосом. Архитектура фибриллы может существенно меняться при модификации N-концевых доменов гистонов, что может стимулировать либо дальнейшую конденсацию, либо деконденсацию фибриллы. Есть данные о том, что ацетилирование гистонов способствует разворачиванию компактной 30 нм хроматиновой фибриллы до нуклеосомной нити.

Рисунок 3. Уровни компактизации хроматина

У ксенопуса выделены белки, контролирующие взаимодействие ДНК с гистоновыми белками. Например, белок нуклеоплазмин - состоит из 5 идентичных субъединиц, контролирует образование нуклеосом. Этот белок кислый, он не связывается со свободной ДНК, связывается только с гистонами.

Экспрессия генов основных гистонов происходит только в S -фазу чтобы обеспечить упаковку вновь синтезированной ДНК. Но ограничение синтеза гистонов может грозить нарушением целостности хромосом, например, при репарации поврежденной ДНК. Поэтому многие организмы имеют альтернативные копии гистоновых генов, которые кодируют варианты гистонов и экспрессируются конститутивно на низком уровне в течение всего клеточного цикла.

Описаны вариантные формы гистонов (табл. 2), которые кодируются отдельными генами. Включение в нуклеосомную частицу вариантных форм гистонов может существенно изменять структуру гистонового октамера. Существует четкая корреляция между присутствием в нуклеосомах вариантных форм гистонов и осуществлением тех или иных функциональных процессов. Например, ряд вариантных форм гистона Н3 (CENP-A) участвует в формировании центромер. Некоторые варианты обмениваются с уже существующими гистонами в ходе развития и дифференцировки - их называют замещающими гистонами. Такое замещение часто приводит к тому, что варианты становятся доминируюшщими в дифференцированной клетке. Предположение - варианты гистонов выполняют спец. функции в клетках.

Имеется много вариантов гистона Н1, например, Н10, Н5, варианты, специфичные для сперматозоидов (SpH1) и яичек (H1t). Наибольшее число вариантов описано для гистона Н2А. Варианты гистона Н2А отличаются по размеру и последовательности хвоста, а также по характеру распределения в геноме. Например, H2A-Bbd локализуется в активной Х-хромосоме и аутосомах, а Macro Н2А находится в основном в Xi. У гистона Н3 есть два основных варианта - Н3ю3 и центромерный Н3 (СеnH3), а также тканеспецифичный вариант Н3.4 (яички млекопитающих). Гистон СеnH3 способствует образованию белковой структуры кинетохоров. Гистон Н3.3 служит меткой активного хроматина, азмещение Н3 на Н3.3 это динамичный механизм быстрой активации хроматина. Вариантов гистона Н4 пока не известно.

Таблица 2

Основные варианты гистонов и их действие на хроматин

	Основной гистон	Действие на хроматин
		Конденсация хроматина
		Конденсация хроматина
		Конденсация хроматина
		Открытая структура хроматина
		Конденсация хроматина
		Открытая структура хроматина
		Конденсация хроматина
		Открытая/закрытая структура хроматина
		Конденсация хроматина
		Открытая структура хроматина

Дальнейшая упаковка хроматина достигается за счет взаимодействия ДНК с негистоновыми белками. Они разнообразны - более 500, составляют до 2/3 всех белков хроматина. Многие из этих белков участвуют в репликации, репарации ДНК, транскрипции. Часть из них выполняет структурную функцию - образуют ядерную мембрану, поровые комплексы. Часть белков формирует белковый каркас хромосом. На белках ядерной мембраны в интерфазу закреплены расположенные розетками петли 30-нм фибриллы. Это третий уровень компактизации хроматина - хромомерный. Средний размер розеток достигает 120-150 нм. Каждый хромомер состоит из нескольких, содержащих нуклеомеры петель, которые связаны в одном центре. Хромомеры связаны друг с другом участками нуклеосомного хроматина. Размер отдельной петли совпадает с размером среднего репликона и может соответствовать одному или нескольким генам (50-100 тпн). На хромосому в среднем приходится более 2000 таких петельных доменов ДНК. Петельно-доменная структура хроматина организует функциональные единицы хромосом - репликоны и транскрибируемые гены. Наряду с участками начала репликации в области прикрепления ДНК к ядерному матриксу часто локализуются и другие регуляторные элементы - энхансеры, сайленсеры, промоторы и т.д. Помещение того или иного промотора, гена или генного домена на ядерный матрикс способствует его активации. Далее - хромонемный уровень компактизации - нитчатая структура толщиной 0,1-0,2 мкм. Полагают, что отрезок примерно с 18-20 петлевыми доменами образует вокруг осевого элемента хромосомы один виток.

Компактизация метафазных хромосом оценивается как 10000-кратная. К стадии зиготены мейоза наружная поверхность хроматиновой нити содержит всего около 1% ДНК. Механизм не известен. Доказано, что укладка ДНК в митотическую хромосому осуществляется комплексом белков, называемым 13S-конденсином . Комплекс обладает АТФ-азной активностью, способен связываться с ДНК и, вероятно, наматывает ее на себя. 13S-конденсин лягушки состоит из двух структурных субъединиц - ассоциированных с хромосомами белков ХСАР-С и ХСАР-Е и трех регуляторных субъединиц. Вне комплекса ни одна из субъединиц не индуцирует конденсацию хромосом. Мутации в генах, кодирующих белки конденсинового комплекса, нарушают конденсацию и сегрегацию хромосом, блокируют клетки в митозе. В процессе упаковки хромосом конденсин локализуется в районах, где гистон Н3 фосфорилирован. По мере фосфорилирования гистона Н3 ДНК становится более доступной для связывания с конденсином. Конденсация хромосом и фосфорилирование гистона Н3 начинается с центромерных областей и распространяется к теломерным.

К стадии зиготены мейоза на наружней поверхности хроматиновой нити остается всего около 1% ДНК.

Степень деконденсации хроматина в интерфазном ядре отражает его функциональную нагрузку. Чем более диффузен хроматин, тем он активнее. В составе хромосом выделяют участки гетерохроматина и эухроматина . Эухроматин в интерфазе находится в деспирализованном состоянии, в нем находятся структурные активные гены. В эухроматиновых участках, помимо элементарных дезоксирибонуклеопротеидных нитей, имеются рибонуклеопротеидные частицы диаметром 200-500 анстрем, называемые РНП-гранулами. Эти частицы представляют собой форму упаковки молекул РНК, синтезированных на ДНК и соединённых с белком, и служат для завершения образования информационной РНК и переноса её в цитоплазму

Термин «гетерохроматин» был предложен Хейцом в 1928 году. Гетерохроматин расположен в районе центромеры, теломер и внутри плеч хромосом - интеркалярный гетерохроматин . Гетерохроматиновые участки значительно дольше представлены в клеточном цикле в виде плотно спирализованных фрагментов. Они деспирализуются значительно позже, чем эухроматин или совсем не деспирализуются, сохраняясь в интерфазном ядре в виде плотно окрашенных глыбок - хромоцентров . Гетерохроматиновые районы хромосом могут ассоциироваться друг с другом - эктопическая конъюгация. В результате здесь возможна повышенная частота хромосомных перестроек. Еще одной особенностью гетерохроматина является варьирование его количества в геноме.

Гетерохроматиновые участки ДНК содержат долгоживущие разрывы, тогда как в эухроматине разрывы возникают редко и быстро репарируются. Ядра лимфоцитов периферической крови почти полностью состоят из гетерохроматина и неактивны в транскрипции. В них обнаружено около 3000 разрывов на диплоидный геном мыши. Установлено, что после активации лимфоцитов разрывы репарируются. Очень плотно упакованная ДНК сперматозоидов содержит 107 разрывов на геном. Таким образом, наличие разрывов ДНК позволяет плотную упаковку, но несовместимо с транскрипцией.

Стабильно выявляемые гетерохроматиновые районы называют конститутивным гетерохроматином. Эти районы, как правило, генетически не активны. Пример - сателлитная ДНК прицентромерного гетерохроматина. Конститутивный гетерохроматин располагается в одних и тех же положениях на обеих хромосомах из пары гомологов. Гены в гетерохроматине все-таки есть, но их гораздо меньше, чем в эухроматине. Пример - гены рРНК.

Факультативный гетерохроматин формируется при конденсации хроматина на определенных стадиях жизненного цикла и обычно присутствует лишь в одной хромосоме из пары гомологов. Яркий пример - мучнистый червец. У самок этого вида нет факультативного гетерохроматина. У самцов весь отцовский гаплоидный набор хромосом целиком становится гетерохроматиновым. В итоге самец имеет эухроматиновые хромосомы, полученные от матери, и гетерохроматиновые, полученные от отца. В ходе мейоза у самцов гетерохроматиновые хромосомы деспирализуются, в спермии попадает уже эухроматиновый материал. Если потомок окажется самцом, то эти хромосомы конденсируются. Таким образом, у самцов экспрессируются только материнские гены.

У млекопитающих факультативный хроматин проявляется при инактивации Х-хромосомы. В 1949 г Барр и Бертрам обнаружили в ядрах нейронов кошки интенсивно окрашенные тельца, названные тельцами Барра . Они представляют собой неактивную Х-хромосому. Различают три возможных расположения полового хроматина в ядре: тесное соприкосновение его с ядрышком; свободное расположение в кариоплазме и контакт с ядерной ембраной.

Таким образом, у самок млекопитающих транскрипционно активна только одна Х-хромосома - это феномен компенсации дозы гена . Факультативный гетерохроматин обогащен повторами типа LINE, которые способствуют конденсации хроматина.

В ходе раннего развития самок млекопитающих обе Х-хромосомы активны. На предимплантационных стадиях развития эмбриона происходит инактивация Х-хромосомы, унаследованной от отца. Во время имплантации зародыша происходит реактивация и последующая инактивация случайно либо отцовской, либо материнской Х-хромосомы. Иногда наблюдается предпочтительная инактивация отцовской Х-хромосомы (у сумчатых). Процесс инактивации контролируется сложным локусом Х-хромосомы - центром инактивации Xiс. Данный локус содержит ген Xist (Х inactive specific transcript). Продуктом этого гена является некодирующая ядерная РНК размером 16 тн.

Ген Xist имеет 3 промотора - Р0, Р1 и Р2. Если транскрипция идет с прототоров Р1 или Р2 - образуется стабильный продукт размером 15 т.п.н., если с промотора Р0 - возникает нестабильный продукт. Переключение транскрипции с Ро на Р1/Р2 коррелирует с началом инактивации Х-хромосомы. В функционально активной Х-хромосоме ген Xist инактивирован за счет метилирования ЦГ-динуклеотидов в промоторе гена.

РНК гена Xist не способна переходить с одной Х-хромосомы на другую. РНК Xist присоединяет различные белки, образуя комплексы, которые распределяются вдоль всей Х-хромосомы, запуская ее инактивацию. Они, несомненно, принимают участие в установлении неактивного состояния, так как Х-хромосома, у которой отсутствует район гена Xist, никогда не инактивируется. Если же ген Xist искусственно перенести на аутосому, то она инактивируется.

В период инициации инактивации продукт гена Xist становится стабильным и распространяется вдоль по всей длине Х-хромосомы. Это подавляет транскрипцию генов и приводит к модификации гистонов. После отделения линии герминальных клеток в соматических клетках происходит гиперметилирование инактивируемой хромосомы; неактивное состояние становится необратимым и наследуется в ряду клеточных поколений. В линии герминальных клеток самок ДНК инактивированной Х-хромосомы остается неметилированной и впоследствии хромосома реактивируется незадолго до вхождения клеток в мейоз. В зрелых ооцитах обе Х-хромосомы активны.

Выбор того, какая Х-хромосома инактивируется, случаен, но это может регулироваться аллелями Xce (X-linced X controlling element). На линиях мышей было обнаружено три аллеля Хсе - «слабый» Xcea, «промежуточный» Xceb и «сильный» Xcec. В гетерозиготах наиболее часто инактивируются те Х-хромосомы, которые несут более слабый аллель. У гомозигот выбор происходит случайно. Xce локус расположен вблизи Xic. Предполагается, что Xce связывают транс-факторы, регулирующие работу генов в Xic, предопределяя выбор между Х-хромосомами.

Ряд генов неактивной Х-хромосомы ускользает от инактивации. Например, избегает инактивации район спаривания с Y-хромосомой. В данном локусе находятся гены, присутствующие и на Х- и на Y-хромосомах: то есть и у XY-самцов таких генов по паре, и у XX-самок их столько же -- этим генам не нужна компенсация дозы.

Образование факультативного гетерохроматина - механизм регуляции активности генов. Пример - мозаичное проявление признаков, контролируемых сцепленными с полом генами у самок млекопитающих - кошки с черепаховой окраской (пятна черной и желтой шерсти); женщины, гетерозиготные по сцепленной с полом мутации эктодермальной дисплазии (на некоторых участках челюсти нет зубов; на теле чередуются участки кожи с наличием и отсутствием потовых желез).

Эпигенетика занимается изучением механизмов наследственности, которые модифицируют работу генов без изменения их структуры. Причем эти модификации сохраняются при митотическом делении клеток. Наиболее часто эпигенетические механизмы обеспечивают долговременную репрессию значительной части генома в специализированных клетках многоклеточного организма. Эпигенетические механизмы обеспечивают и импринтинг - инактивацию ряда генов в одной из родительских хромосом. Наиболее изученным механизмом является метилирование ДНК . В последние годы показана роль модификации гистонов , их ацетилирования (лизина) и метилирования (лизина и аргинина), а также включения в нуклеосомы неканонических форм гистонов. Модифицируются в основном свободные N-концы гистонов. Добавление ацетильных групп нейтрализует положительный заряд молекулы гистона, это изменяет конформацию нуклеосомы и изменяет доступность ДНК для различных белков. Другой вариант - с модифицированными остатками аминокислот гистонов могут специфически связываться определенные белки, запуская цепочку реакций. Метилирование лизина и аргинина участвует в образовании гетерохроматина, репарации и регуляции транскрипции. Причем разное число метильных групп у одного остатка выполняет разные биологические функции. Метилирование осуществляется ферментами гистон-метилтрансферазами , а удаление метильных групп обеспечивают гистон-деметилазы . В отличие от метилирования ацетильная группа на остатке лизина может быть только одна. Ее присоединение осуществляют гистон-ацетилтрансферазы , а удаление - гистон-деацетилазы. Эухроматиновые домены характеризуются гиперацетилированной формой гистонов; в гетерохроматине гистоны гипоацетилированы.

Ацетилирование гистонов ослабляет межнуклеосомное взаимодействие, а также взаимодействие хвостов нуклеосомы с линкерной ДНК. Доступность ДНК при этом увеличивается, то есть ацетилирование гистонов связано с активацией транскрипции.

Активный промотор гена должен быть свободен от нуклеосом. Важную роль в этом играет ацетилирование гистонов, в том числе гистона H2A.Z в промоторной области. Гистон H2A.Z присутствует как в активных, так и в неактивных промоторах и именно его ацетилирование существенно для активации промотора.

Метилирование гистонов не изменяет суммарный заряд нуклеосомы. Но ковалентно модифицированные гистоны служат «метками» для связывания белковых факторов, которые стимулируют определенные события. Наиболее распространенный вариант метилирования гистонов - это метилирование лизина.

Образование прицентромерного гетерохроматина является результатом модификации гистонов и прежде всего метилированием лизина в молекуле гистонов Н3 и Н4. Метилированные остаток лизина узнают различные белки, которые запускают процессы, связанные с «молчанием». Например, у инфузории с метилированным лизином связываются белки Pddq, Pdd3 , что вызывает диминуцию хроматина. У млекопитающих и дрозофилы модифицированный гистон Н3 может взаимодействовать с белком НР1 (Heterochromatin protein 1 ), который в свою очередь может привлекать множество других белков. Полагают, что связь НР1 с модифицированным гистоном Н3 необходима для стабилизации репрессированного состояния гетерохроматина.

Инактивация Х-хромосомы млекопитающих сопровождается гипоацетилированием гистонов Н2А, Н3 и Н4 и метилированием гистона Н3.

Другим вариантом модификации гистонов является их фосфорилирование - дефосфорилирование, что обеспечивает декомпактизацию хроматина при активации транскрипции и конденсацию хромосом во время деления клетки или апоптоза. Баланс фосфатных групп поддерживают киназы и фосфотазы.

Образец модификаций молекул гистонов называют «гистоновым кодом» . Гипотеза «гистонового кода» предполагает, что эти модификации являются предпосылкой для последующего изменения структуры хроматина и стабильно поддерживают характер экспрессии генов в ходе клеточных делений. Посттрансляционные модификации гистонов (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и др.) создают специфические сайты связывания для регуляторных белков хроматина.

Формирование гетерохроматина строго детерминировано и происходит на определенной стадии эмбрионального развития, когда начинается транскрипция на хромосомах развивающегося эмбриона. Формирование гетерохроматиновых доменов надежно защищает организм от экспрессии генетического материала, которая не нужна в соматических клетках.

Помимо образования гетерохроматина другим механизмом «выключения» некодирующих последовательностей является диминуция хроматина. Это программируемая элиминация части генетического материала из генома презумптивных соматических клеток.

У циклопов в 3-7 делениях дробления элиминируется от 10 до 94% генома germ line. Цитологическая картина диминуции хроматина видоспецифична. Доля элиминируемой ДНК не зависит от исходного размера генома. Например, 2 вида циклопов Cyclops kolensis, Cyclops insignis обитают в одинаковых условиях, количество ДНК в диплоидных клетках примерно одинаково - 4,6 пг и 4,3 пг. У C. kolensis после диминуции остается лишь 6% генома. Однако при этом количество хромосом не изменяется (22), хотя размеры их становятся существенно меньше. У C. insignis диминуции хроматина не происходит.

У циклопов перед диминуцией хроматина происходит удлинение интерфазы в 8-9 раз. В конце этой интерфазы появляются плотные гранулы хроматина (до 600). Далее они сливаются, вокруг них формируется плотная однослойная без пор мембрана, непрницаемая для факторов декомпактизации. Внутри этих гранул происходит лизис ДНК.

Генетический аппарат ресничных инфузорий отличается ядерным диморфизмом. Он проявляется в наличии в клетке двух типов ядер: микронуклеуса (Ми) и макронуклеуса (Ма). Ми служит генеративным ядром, используемым для передачи наследственной информации в ряду поколений. В вегетативно растущих клетках гены Ми не транскрибируются. Зато активно транскрибируются гены Ма, выполняющего роль рабочего ядра и контролирующего процессы жизнедеятельности.

При конъюгации у инфузорий две клетки прикладываются друг к другу и плавают вместе 10-12 часов, а затем расходятся. За время конъюгации их Ма начали разрушаться, а Ми поделились путем мейоза на четыре гаплоидных ядра каждое. Ход последующих событий варьирует в деталях у разных видов инфузорий, но принципиальная схема общая: клетки партнеров обмениваются гаплоидными ядрами, по одному от каждой клетки, затем каждое сливается с местным (стационарным) гаплоидным ядром, то есть происходит оплодотворение. К этому моменту все лишние ядра дегенерируют, и в каждой клетке остается по одному диплоидному ядру - продукту оплодотворения. После расхождения партнеров ядро делится митотически на два. Одно из дочерних ядер останется Ми, другое превратится в Ма. Развитие Ма занимает несколько дней и сопровождается полной реорганизацией генома Ми-предшественника.

ДНК хромосом Ми имеет большие размеры, характерные для эукариотических хромосом. Гены в них собраны в группы с длинными промежутками между ними, заполненными разнообразными уникальными и повторяющимися последовательностями ДНК. Важная особенность генов Ми заключается в том, что все они прерваны особыми элементами, называемым IES (internal eliminated sequences). Кодирующие участки генов, разделенные IES, называют MDS (macronuclear destined sequences). Каждая IES уникальна. Размеры изученных IES варьируют от 14 до 548 п.н.

Вся ДНК в Ма представлена короткими молекулами с размерами от нескольких сот п.н. до 15 т.п.н., не содержащими никаких IES. Каждая молекула содержит одну единицу транскрипции и соответствует одному гену. Она окаймлена теломерами в виде повторов нуклеотидов, например повторов 5"-С4А4 у Oxytricha, то есть каждый ген в Ма является отдельной хромосомой. Каждый ген-хромосома представлен множеством (до тысячи, у некоторых генов до десятков тысяч) копий.

Рисунок 4. Дифференцировка Ма у брюхоресничных инфузорий: а - общая схема дифференцировки ядер из оплодотворенного ядра; б - схема превращения микроядерного гена в ген Ма

Перестройка генетического материала происходит при развитии Ма из Ми. Она начинается сразу после конъюгации с множественных раундов репликации хромосом в исходном Ми без его деления. Это приводит к образованию политенных хромосом. Политенизация хромосом увеличивает их размеры.

Во время политенизации происходит важное для реорганизации генома Ми удаление всех IES. Оно осуществляется путем множественных событий рекомбинации по прямым повторам ДНК, имеющимся на концах каждого IES. У E. crassus IES несут концевые повторы от 2 до 4 п.н. и всегда содержат димер 5"-TA, у O. nova - от 2 до 19 п.н. и не содержат 5"-TA. Поскольку IES прерывают кодирующие участки генов (MDS), состыковка последних при вырезании IES (в виде колец) происходит с точностью до нуклеотида по той же схеме, что и аналогичная рекомбинация у бактерий. Помимо коротких IES ДНК Ми E. crassus содержит два родственных элемента размером около 5,3 т.п.н., называемых TEC1 и TEC2. Эти элементы принадлежат к подвижным генетическим элементам. TEC-элементы представлены в Ми примерно 30 тыс. копиями и все вырезаются в виде колец.

После политенизации и удаления IES и подвижных элементов происходит разрезание политенных хромосом на фрагменты, соответствующие отдельным генам. Механизм фрагментации хромосом пока невыяснен. У равноресничных инфузорий, к которым принадлежит всем известная инфузория-туфелька, обнаружены особые участки, в которых происходят разрывы хромосом. Их называют CBS (chromosome breakage sequences). У брюхоресничных такие участки не обнаружены.

Фрагментация хромосом сопровождается массовым удалением и распадом всех других последовательностей ДНК, расположенных в межгенных промежутках. Окончательно исчезают остатки ядер и вырезанные раньше кольцевые ДНК.

Оставшиеся сегменты воссоединяются. При этом возможно изменение порядка расположения экзонов структурных генов. Например, в микронуклеусе неработающий ген состоит из экзонов 3 4 6 5 7 9 2 1 8. В макронуклеусе порядок экзонов меняется на 1 2 3 4 5 6 7 8 9, в результате возможна нормальная транскрипция гена.

В целом удаленная часть генома составляет 90-95%. На концах вырезанных генов (а они уже представлены многими копиями в результате политенизации) синтезируются теломеры (это делает фермент теломераза), после чего они дополнительно умножаются примерно до тысячи копий путем 4-6 раундов репликации. На этом дифференцировка Ма завершается, и инфузория возвращается к обычной жизни.

Диминуция хроматина у аскарид . Диминуция заключается в фрагментации хромосом и элиминации значительной части хроматина в предшественницах соматических клеток в ходе первых делений оплодотворенной яйцеклетки. Результатом этого процесса являются разная структура хромосом и разное содержание ДНК в соматических и генеративных клетках. Цитологическую картину диминуции хроматина можно рассмотреть на примере лошадиной аскариды Parascaris univalens , у которой в диплоидном ядре оплодотворенной яйцеклетки находятся всего две крупные гомологичные хромосомы (рис. 4). Первое деление дробления происходит путем обычного митоза, где хроматиды нормально распределяются по двум дочерним клеткам, обозначенным как Г1 и С1. При втором делении дробления (рис. 4, а) такой же нормальный митоз повторяется в клетке Г1, расположенной на брюшной стороне будущего зародыша. Он приводит к клеткам Г2 и С2. Другая судьба у клетки С1, в которой центральная часть хроматид распадается на большое число фрагментов. Разрывы, приводящие к образованию фрагментов, происходят в определенных участках, имеющих соответствующее название - CBR (cromosomal breakage regions). С помощью теломеразы на их концах синтезируются теломеры. Только эти фрагменты отходят в анафазе в два дочерних ядра, где становятся мелкими хромосомами, тогда как крупные концевые части хроматид остаются в экваториальной плоскости и тем самым впоследствии оказываются вне ядра, где в конечном счете элиминируются. В результате ядра двух дочерних клеток С1а и С1б содержат меньше хроматина по сравнению с клетками С2 и Г2. Это и есть диминуция хроматина. В ходе дальнейшего развития эмбриона диминуция повторяется еще три раза в клетках С2, С3 и С4, являющихся предшественницами соматических клеток (рис. 5, б). Из избежавших диминуции клеток линии, обозначаемой на рисунке буквой Г в ходе дальнейшей дифференцировки образуются генеративные клетки.

Для осуществления диминуции важно, что хромосомы нематод являются полицентрическими, то есть имеют диффузные центромеры. В митозах, сопровождаемых диминуцией, нити веретена прикрепляются только к неэлиминируемым фрагментам хроматид, что объясняет последующие события. Напротив, в митотических клетках зародышевого пути непрерывный кинетохор распространяется на всю длину хроматиды.

Рисунок 5. Диминуция хроматина у Parascaris univalens: а - цитологическая картина диминуции хроматина

На левой схеме изображены анафазы второго деления дробления на стадии двух клеток. Диминуция происходит в верхней клетке С1. В нижней клетке Г1 идет нормальный митоз. Справа представлена стадия четырех клеток после завершения второго деления дробления; б - схема дифференцировки клеток зародышевого пути и соматических клеток на ранних стадиях эмбрионального развития аскариды. Пресоматические клетки С1, С2, С3 и С4, подвергшиеся диминуции, изображены кружками, окруженными четырьмя точками.

У P. univalens при диминуции удаляется около 85% хроматина. Основная часть удаляемого материала состоит из сателлитной ДНК. Однако при диминуции удаляются и некоторые уникальные гены, например ген ALEP1 , который кодирует определенный рибосомный белок. Этот белок синтезируется только в генеративных клетках и отсутствует в соматических. Таким образом, элиминируемый хроматин содержит не просто ненужную ДНК, но необходим для клеток зародышевого пути. Предполагается, что элиминация гена ALEP1 вызывает структурные различия между рибосомами зародышевых и соматических клеток, которые могут обусловливать дифференциальную трансляцию специфических мРНК в двух типах клеток.

Эффект диминуции хроматина указывает на то, что большая часть избыточной ДНК не несет ни кодирующих, ни регуляторных функций. Функции избыточной ДНК как-то связаны с клетками germ line. Возможно, что некодирующая часть генома играет важную роль в изоляции видов, осуществляемой в мейозе при конъюгации хромосом.

При случайном скрещивании видов с диминуцией хроматина и без диминуции: В яйцеклетке в ее цитоплазме у видов с диминуцией хроматина есть ферменты, участвующие в диминуции хроматина. В результате диминуции хроматина могут подвергнуться структурные гены отцовского происхождения. Потеря структурных генов - гибель гибридного зародыша.

При обратном направлении скрещивания отцовские хромосомы не пройдут через цикл диминуции хроматина, так как в яйцеклетке не будет нужных ферментов. В результате отцовские структурные гены останутся в неактивной форме. Зародыш тоже погибнет.

Хроматин (от греч. сhroma - цвет краска) - это основная структура интерфазного ядра, которая очень хорошо красится основными красителями и обуславливает для каждого типа клеток хроматиновый рисунок ядра.

Благодаря способности хорошо окрашиваться различными красителями и особенно основными этот компонент ядра и получил название «хроматин» (Флемминг 1880).

Хроматин является структурным аналогом хромосом и в интерфазном ядре представляет собой несущие ДНК тельца.

Морфологически различают два вида хроматина:

1) гетерохроматин;

2) эухроматин.

Гетерохроматин (heterochromatinum) соответствует частично конденсированным в интерфазе участкам хромосом и является функционально неактивным. Этот хроматин очень хорошо окрашивается и именно его можна видеть на гистологических препаратах.

Гетерохроматин в свою очередь делится на:

1) структурный; 2) факультативный.

Структурный гетерохроматин представляет участки хромосом, которые постоянно находятся в конденсированном состоянии.

Факультативный гетерохроматин - это гетерохроматин, способный деконденсироваться и превращатся в эухроматин.

Эухроматин - это деконденсированные в интерфазе участки хромосом. Это рабочий, функционально активный хроматин. Этот хроматин не окрашивается и не обнаруживается на гистологических препаратах.

Во время митоза весь эухроматин максимально конденсируется и входит в состав хромосом. В этот период хромосомы не выполняют никаких синтетических функций. В связи с этим хромосомы клеток могут находится в двух структурно-функциональных состояниях:

1) активном (рабочем), иногда они частично или полностью деконденсированы и с их участием в ядре происходят процессы транскрипции и редупликации;

2) неактивном (нерабочем, метаболического покоя), когда они максимально конденсированы выполняют функцию распределения и переноса генетического материала в дочерние клетки.

Иногда в отдельных случаях целая хромосома в период интерфазы может оставаться в конденсированном состоянии, при этом она имеет вид гладкого гетерохроматина. Например, одна из Х-хромосом соматических клеток женского организма подлежит гетерохроматизации на начальных стадиях эмбриогенеза (во время дробления) и не функционирует.

Этот хроматин называется половых хроматином или тельцами Барра.

В разных клетках половой хроматин имеет различный вид:

а) в нейтрофильных лейкоцитах - вид барабанной палочки;

б) в эпителиальных клетках слизистой - вид полусферической глыбки.

Определение полового хроматина используется для установления генетического пола, а также для определения количества Х-хромосом в кариотипе индивидума (оно равняется количеству телец полового хроматина+1).

При электронно-микроскопических исследованиях установлено, что препараты выделенного интерфазного хроматина содержат элементарные хромосомные фибриллы толщиной 20-25 нм, которые состоят из фибрилл толщиной 10 нм.

В химическом отношении фибриллы хроматина представляют собой сложные комплексы дезоксирибонуклеопротеидов, в состав которых входят:

б) специальные хромосомные белки;

Количественное соотношение ДНК, белка и РНК составляет 1:1,3:0,2. На долю ДНК в препарате хроматина приходится 30-40%. Длина индивидуальных линейных молекул ДНК колеблется в непрямых пределах и может достигать сотен микрометров и даже сантиметров. Суммарная длина молекул ДНК во всех хромосомах одной клетки человека составляет около 170 см, что соответствует 6х10 -12 г.

Белки хроматина составляют 60-70% от его сухой массы и представлены двумя группами:

а) гистоновыми белками;

б) негистоновыми белками.

ЁГистоновые белки (гистоны ) - щелочные белки, содержащие основные аминокислоты (главным образом лизин, аргинин) располагаются неравномерно в виде блоков по длине молекулы ДНК. Один блок содержит 8 молекул гистонов, которые образуют нуклеосому. Размер нуклеосомы около 10 нм. Нуклеосома образуется путем компактизации и сверхспирализации ДНК, что приводит к укорачиванию длины хромосомной фибриллы примерно в 5 раз.

ЁНегистоновые белки составляют 20% от количества гистонов и в интерфазных ядрах образуют внутри ядра структурную сеть, которая носит название ядерного белкового матрикса. Этот матрикс представляет основу, которая определяет морфологию и метаболизм ядра.

Перихроматиновые фибриллы имеют толщину 3-5 нм, гранулы имеют диаметр 45нм и интерхроматиновые гранулы имеют диаметр 21-25 нм.

Хроматин (от греч. chroma - краска) мелкие зернышки и глыбки материала, который обнаруживается в ядре клеток и окрашивается ос­новными красителями. Хроматин состоит из Комплекса ДНК и белка И соответствует хромосомам, которые в интерфазном ядре представлены длинными, тонкими перекрученными нитями и неразличимы как индивидуальные структуры. Выраженность спирализапии каждой из хромо­сом неодинакова по их длине. Различают два вида хроматина - Эухроматин и гетерохроматин.

Эухроматин. Соответствует сегментам хромосом, которые Деспира-лизованы и открыты для транскрипции. Эти сегменты Не окрашива­ются И не видны в световой микроскоп.

Гетерохроматин. Соответствует Конденсированным, Плотно скру­ченным сегментам хромосом (что делает их Недоступными для транс­крипции). Он Интенсивно окрашивается Основными красителями, и в световом микроскопе имеет вид гранул.

Таким образом, По морфологическим признакам ядра (соотноше­нию содержания эу - и гетерохроматина) можно оценить активность процессов транскрипции, а, следовательно, синтетической функции клетки. При ее повышении это соотношение изменяется в пользу эухроматина, при снижении - нарастает содержание гетерохроматина. При полном подавлении функции ядра (например, в поврежденных и гибну­щих клетках, при ороговении эпителиальных клеток эпидермиса - кера-тиноцитов, при образовании ретикулоцитов крови) оно уменьшается в размерах, содержит только гетерохроматин и окрашивается основны­ми красителями интенсивно и равномерно. Такое явление называется Кариопикнозом (от греч. karyon - ядро и pyknosis - уплотнение).

Распределение гетерохроматина (топография его частиц в яд­ре) и соотношение содержания эу - и гетерохроматина Характерны для клеток каждого типа, что позволяет осуществлять их идентификацию как визуально, так и с помощью автоматических анализаторов изобра­жения. Вместе с тем, имеются определенные общие закономерности распределения гетерохроматина В ядре: его скопления располагают­ся Под кариолеммой, прерываясь в области пор (что обусловлено его связью с ламиной) и вокруг ядрышка (Перинуклеолярный гетерохроматин), более мелкие глыбки разбросаны по всему ядру.

Тельце Барра - Скопление гетерохроматина, соответствующее од­ной Х-хромосоме у особей женского пола, которая в интерфазе плотно скручена и неактивна. В большинстве клеток оно лежит у кариолеммы, а в гранулоцитах крови имеет вид маленькой добавочной дольки ядра ("барабанной палочки"). Выявление тельца Барра (обычно в эпителиальных клетках слизистой оболочки полости рта) используется как ди­агностический тест для определения генетического пола (обязателен, в частности, для женщин, участвующих в Олимпийских Играх).

Упаковка хроматина в ядре. В дсконденсированном состоянии длина одной молекулы (двойной спирали) ДНК, образующей каждую хромосому, равна в среднем, около 5 см, а общая длина молекул ДНК всех хромосом в ядре (диаметром около 10 мкм) составляет более 2 м (что сравнимо с укладкой нити длиной 20 км в теннисный мячик диа­метром около 10 см), а в S-период интерфазы - более 4 м. Конкретные механизмы, препятствующие спутыванию этих нитей во время транс­крипции и репликации, остаются нераскрытыми, однако очевидна необ­ходимость Компактной упаковки молекул ДНК, В клеточном ядре это осуществляется благодаря их связи со специальными основными (гистоновыми) белками. Компактная упаковка ДНК в ядре обеспечивает:

(1) Упорядоченное расположение Очень длинных молекул ДНК в небольшом объеме ядра;

(2) функциональный Контроль активности генов (вследствие вли­яния характера упаковки на активность отдельных участков генома.

Уровни упаковки хроматина . Начальный уровень упа­ковки хроматина, обеспечивающий образование Нуклеосомной нити Ди­аметром 11 нм, обусловлен намоткой двойной нити ДНК (диаметром 2 нм) на блоки дисковидной формы из 8 гистоновых молекул (нуклеосомы). Нуклеосомы разделены короткими участками свободной ДНК. Второй уровень упаковки также обусловлен гистонами и приводит к скручиванию нуклеосомной нити с формированием Хроматиновой фибриллы Диаметром 30 нм. В интерфазе хромосомы образованы хроматиновыми фибриллами, причем каждая хроматида состоит из одной фибриллы. При дальнейшей упаковке хроматиновые фибриллы образу­ют Петли (петельные домены) Диаметром 300 нм, каждый из которых соответствует одному или нескольким генам, а те, в свою очередь, в результате еще более компактной укладки, формируют участки конденси­рованных хромосом, которые выявляются лишь при делении клеток.

В хроматине ДНК связана помимо гастонов также и с Негистоновыми белками, Которые Регулируют активность генов. Вместе с тем, и гистоны, ограничивая доступность ДНК для других ДНК-связьвзающих белков, могут участвовать в регулядии активности генов.

Функция хранения генетической информации В ядре в неизме­ненном виде имеет исключительно важное значение для нормальной жизнедеятельности клетки и всего организма. Подсчитано, что при ре­пликации ДНК и в результате ее повреждений внешними факторами в каждой клетке человека ежегодно происходят изменения 6 нуклеотидов. Возникшие повреждения молекул ДНК могут исправляться в ре­зультате процесса Репарации Или путем Замещения После Распознава­ния и маркировки соответствующего участка.

В случае невозможности репарации ДНК при слишком значитель­ных повреждениях включается механизм запрограммированной гибели клетки . В этой ситуации "поведение" клетки можно оценить как своего рода "альтруистическое самоубийство": ценой своей гибели она спасает организм от возможных негативных последствий реплика­ции и амплификации поврежденного генетического материала.

Способность к репарации ДНК у Взрослого человека снижается примерно на 1% с каждым годом. Это снижение может отчасти объяс­нить, почему старение является фактором риска развития злокачест­венных заболеваний. Нарушения процессов репарации ДНК Характерно для ряда наследственных болезней, при которых резко Повышены Как Чувствительность к повреждающим факторам, Так и Частота разви­тия злокачественных новообразований.

Функция Реализации генетической информации В интерфазном ядре осуществляется непрерывно благодаря процессам Транскрипции. Геном млекопитающих содержит около ЗхЮ9 нуклеотидов, однако не более 1% его объема кодирует важные белки и принимает участие в ре­гуляции их синтеза. Функции основной некодирующей части генома не­известны.

При транскрипции ДНК образуется очень крупная молекула РНК (первичный транскрипт), которая связывается с ядерными белками с образованием Рибонуклеопротеинов (РНП). В первичном РНК-транс­крипте (как и в матричной ДНК) имеются дискретные значащие после­довательности нуклеотидов (экзоны), Разделенные длинными некодирующими вставками (нитронами). Процессинг РНК-транскрипта включает отщепление нитронов и стыковку экзонов - сплайсинг (от англ, splicing - сращивание). При этом очень крупная молекула РНК превращается в достаточно мелкие молекулы иРНК, отделяющиеся от связанных с ни­ми белков при переносе в цитоплазму.

Как правило, эукариотическая клетка имеет одно ядро , но встречаются двуядерные (инфузории) и многоядерные клетки (опалина). Некоторые высоко-специализи-рованные клетки вторично утрачивают ядро (эритроциты млекопитающих, ситовидные трубки покрытосеменных).

Форма ядра — сферическая, эллипсовидная, реже лопастная, бобовидная и др. Диаметр ядра — обычно от 3 до 10 мкм.

1 — наруж-ная мембрана; 2 — внут-ренняя мемб-рана; 3 — поры; 4 — ядрышко; 5 — гетеро-хроматин; 6 — эухро-матин.

Ядро отграничено от цитоплазмы двумя мембранами (каждая из них имеет типичное строение). Между мембранами — узкая щель, заполненная полужидким веществом. В некоторых местах мембраны сливаются друг с другом, образуя поры (3), через которые происходит обмен веществ между ядром и цитоплазмой. Наружная ядерная (1) мембрана со стороны, обращенной в цитоплазму, покрыта рибосомами, придающими ей шероховатость, внутренняя (2) мембрана гладкая. Ядерные мембраны являются частью мембранной системы клетки: выросты наружной ядерной мембраны соединяются с каналами эндоплазматической сети, образуя единую систему сообщающихся каналов.

Кариоплазма (ядерный сок, нуклеоплазма) — внутреннее содержимое ядра, в котором располагаются хроматин и одно или несколько ядрышек. В состав ядерного сока входят различные белки (в том числе ферменты ядра), свободные нуклеотиды.

Ядрышко (4) представляет собой округлое плотное тельце, погруженное в ядерный сок. Количество ядрышек зависит от функционального состояния ядра и варьирует от 1 до 7 и более. Ядрышки обнаруживаются только в неделящихся ядрах, во время митоза они исчезают. Ядрышко образуется на определенных участках хромосом, несущих информацию о структуре рРНК. Такие участки называются ядрышковым организатором и содержат многочисленные копии генов, кодирующих рРНК. Из рРНК и белков, поступающих из цитоплазмы, формируются субъединицы рибосом. Таким образом, ядрышко представляет собой скопление рРНК и рибосомальных субъединиц на разных этапах их формирования.

Хроматин — внутренние нуклеопротеидные структуры ядра, окрашивающиеся некоторыми красителями и отличающиеся по форме от ядрышка. Хроматин имеет вид глыбок, гранул и нитей. Химический состав хроматина: 1) ДНК (30-45%), 2) гистоновые белки (30-50%), 3) негистоновые белки (4-33%), следовательно, хроматин является дезоксирибонуклеопротеидным комплексом (ДНП). В зависимости от функционального состояния хроматина различают: гетерохроматин (5) и эухроматин (6). Эухроматин — генетически активные, гетерохроматин — генетически неактивные участки хроматина. Эухроматин при световой микроскопии не различим, слабо окрашивается и представляет собой деконденсированные (деспирализованные, раскрученные) участки хроматина. Гетерохроматин под световым микроскопом имеет вид глыбок или гранул, интенсивно окрашивается и представляет собой конденсированные (спирализованные, уплотненные) участки хроматина. Хроматин — форма существования генетического материала в интерфазных клетках. Во время деления клетки (митоз, мейоз) хроматин преобразуется в хромосомы.

Функции ядра: 1) хранение наследственной информации и передача ее дочерним клеткам в процессе деления, 2) регуляция жизнедеятельности клетки путем регуляции синтеза различных белков, 3) место образования субъединиц рибосом.

— это цитологические палочковидные структуры, представляющие собой конденсированный хроматин и появляющиеся в клетке во время митоза или мейоза. Хромосомы и хроматин — различные формы пространственной организации дезоксирибонуклеопротеидного комплекса, соответствующие разным фазам жизненного цикла клетки. Химический состав хромосом такой же, как и хроматина: 1) ДНК (30-45%), 2) гистоновые белки (30-50%), 3) негистоновые белки (4-33%).

Основу хромосомы составляет одна непрерывная двухцепочечная молекула ДНК; длина ДНК одной хромосомы может достигать нескольких сантиметров. Понятно, что молекула такой длины не может располагаться в клетке в вытянутом виде, а подвергается укладке, приобретая определенную трехмерную структуру, или конформацию. Можно выделить следующие уровни пространственной укладки ДНК и ДНП: 1) нуклеосомный (накручивание ДНК на белковые глобулы), 2) нуклеомерный, 3) хромомерный, 4) хромонемный, 5) хромосомный.

В процессе преобразования хроматина в хромосомы ДНП образует не только спирали и суперспирали, но еще петли и суперпетли. Поэтому процесс формирования хромосом, который происходит в профазу митоза или профазу 1 мейоза, лучше называть не спирализацией, а конденсацией хромосом.

1 — метацентрическая; 2 — субметацентрическая; 3, 4 — акроцентрические. Строение хромосомы: 5 — центромера; 6 — вторичная перетяжка; 7 — спутник; 8 — хроматиды; 9 — теломеры.

Метафазная хромосома (хромосомы изучаются в метафазу митоза) состоит из двух хроматид (8). Любая хромосома имеет первичную перетяжку (центромеру) (5), которая делит хромосому на плечи. Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку (6) и спутник (7). Спутник — участок короткого плеча, отделяемый вторичной перетяжкой. Хромосомы, имеющие спутник, называются спутничными (3). Концы хромосом называются теломерами (9). В зависимости от положения центромеры выделяют: а) метацентрические (равноплечие) (1), б) субметацентрические (умеренно неравноплечие) (2), в) акроцентрические (резко неравноплечие) хромосомы (3, 4).

Соматические клетки содержат диплоидный (двойной — 2n) набор хромосом, половые клетки — гаплоидный (одинарный — n). Диплоидный набор аскариды равен 2, дрозофилы — 8, шимпанзе — 48, речного рака — 196. Хромосомы диплоидного набора разбиваются на пары; хромосомы одной пары имеют одинаковое строение, размеры, набор генов и называются гомологичными .

Кариотип — совокупность сведений о числе, размерах и строении метафазных хромосом. Идиограмма — графическое изображение кариотипа. У представителей разных видов кариотипы разные, одного вида — одинаковые. Аутосомы — хромосомы, одинаковые для мужского и женского кариотипов. Половые хромосомы — хромосомы, по которым мужской кариотип отличается от женского.

Хромосомный набор человека (2n = 46, n = 23) содержит 22 пары аутосом и 1 пару половых хромосом. Аутосомы распределены по группам и пронумерованы:

Группа	Число пар	Номер	Размер	Форма
A	3	1, 2, 3	Крупные	1, 3 — метацентрические, 2 — субметацентрические
B	2	4, 5	Крупные	Субметацентрические
C	7	6, 7, 8, 9, 10, 11, 12	Средние	Субметацентрические
D	3	13, 14, 15	Средние
E	3	16, 17, 18	Мелкие	Субметацентрические
F	2	19, 20	Мелкие	Метацентрические
G	2	21, 22	Мелкие	Акроцентрические, спутничные (вторичная перетяжка в коротком плече)

Половые хромосомы не относятся ни к одной из групп и не имеют номера. Половые хромосомы женщины — ХХ, мужчины — ХУ. Х-хромосома — средняя субметацентрическая, У-хромосома — мелкая акроцентрическая.

Хроматин – основной компонент клеточного ядра – достаточно легко получить из выделенных интерфазных ядер и из выделенных митотических хромосом. Для этого используют его свойство переходить в растворенное состояние при экстракции водными растворами с низкой ионной силой или просто деионизованной водой. При этом участки хроматина набухают и переходят в гель. Чтобы такие препараты перевести в настоящие растворы, необходимы сильные механические воздействия: встряхивание, перемешивание, дополнительная гомогенизация. Это, конечно, приводит к частичному разрушению исходной структуры хроматина, дробит его на мелкие фрагменты, но практически не меняет его химического состава.

Фракции хроматина, полученные из разных объектов, обладают довольно однообразным набором компонентов. Было найдено, что суммарный химический состав хроматина из интерфазных ядер и митотических хромосом мало отличаются друг от друга. Главными компонентами хроматина являются ДНК и белки, среди которых основную массу составляют гистоны и негистоновые белки (см табл. 3).

Таблица 3. Химический состав хроматина. Содержание белков и РНК дано по отношению к ДНК

В среднем в хроматине около 40% приходится на ДНК и около 60 % на белки, среди которых специфические ядерные белки-гистоны , составляют от 40 до 80% от всех белков, входящих в состав выделенного хроматина. Кроме того в состав хроматиновой фракциии входят мембранные компоненты, РНК, углеводы, липиды, гликопротеиды. Вопрос о том, насколько эти минорные компоненты входят в структуру хроматина еще не решен. Так, например, РНК может представлять собой транскрибируемую РНК, которая еще не потеряла связь с матрицей ДНК. Другие же минорные компоненты могут представлять собой вещества соосажденных фрагментов ядерной оболочки.

В структурном отношении хроматин представляет собой нитчатые комплексные молекулы дезоксирибонуклеопротеида (ДНП), которые состоят из ДНК, ассоциированной с гистонами (см. рис. 57). Поэтому укоренилось другое название хроматина – нуклеогистон . Именно за счет ассоциации гистонов с ДНК образуются очень лабильные, изменчивые нуклеиново-гистоновые комплексы, где отношения ДНК: гистон равно примерно единице, т.е. они присутствуют в равных весовых количествах. Эти нитчатые фибриллы ДНП и есть элементарные хромосомные или хроматиновые нити, толщина которых в зависимости от степени упаковки ДНК может колебаться от 10 до 30 нм. Эти фибриллы ДНП могут в свою очередь дополнительно компактизоваться с образованием более высоких уровней структуризации ДНП, вплоть до митотической хромосомы. Роль некоторых негистоновых белков заключается именно в образовании высоких уровней компактизации хроматина.

ДНК хроматина

В препарате хроматина на долю ДНК приходится обычно 30-40%. Эта ДНК представляет собой двухцепочечную спиральную молекулу подобно чистой выделенной ДНК в водных растворах. Об этом говорят многие экспериментальные данные. Так, при нагревании растворов хроматина наблюдается повышение оптической плотности раствора, так называемый гиперхромный эффект, связанный с разрывом межнуклеотидных водородных связей между цепями ДНК, подобно тому, что происходит при нагревании (плавлении) чистой ДНК.

Вопрос о размере, длине молекул ДНК в составе хроматина имеет важное значение для понимания структуры хромосомы в целом. При стандартных методах выделения ДНК хроматина обладает молекулярной массой 7-9 х 10 6 , что значительно меньше молекулярной массы ДНК из кишечной палочки (2,8 х 10 9). Такую сравнительно малую молекулярную массу ДНК из препаратов хроматина можно объяснить механическими повреждениями ДНК в процессе выделения хроматина. Если же выделять ДНК в условиях, исключающих встряхивание, гомогенизацию и другие воздействия, то удается из клеток получить молекулы ДНК очень большой длины. Длина молекул ДНК из ядер и хромосом эукариотических клеток может быть изучена с помощью метода светооптической радиоавтографии, подобно тому как это изучалось на прокариотических клетках.

Было обнаружено, что в составе хромосом длина индивидуальных линейных (в отличие от прокариотических хромосом) молекул ДНК может достигать сотен микрометров и даже нескольких сантиметров. Так, у разных объектов были получены молекулы ДНК от 0,5 мм до 2 см. Эти результаты показали, что есть близкое совпадение между расчетной длиной ДНК на хромосому и радиоавтографическим наблюдением.

После мягкого лизиса клеток эукариот можно прямо определять молекулярные массы ДНК физико-химическими методами. Было показано, что максимальная молекулярная масса молекулы ДНК дрозофилы равна 41 х 10 9 , что соответствует длине около 2 см. У некоторых дрожжей на хромосому приходится молекула ДНК с молекулярной массой 1 х 10 8 -10 9 , которая имеет размеры около 0,5 мм.

Такие длинные ДНК представляют собой одну молекулу, а не несколько более коротких, сшитых гуськом с помощью белковых связок, как считали некоторые исследователи. К этому заключению пришли после того, как оказалось, что длина молекул ДНК не изменяется после обработки препаратов протеолитическими ферментами.

Общее количество ДНК, входящее в ядерные структуры клеток, в геном организмов, колеблется от вида к виду, хотя у микроорганизмов количество ДНК на клетку значительно ниже, чем у беспозвоночных, высших растений и животных. Так, у мыши на ядро приходится почти в 600 раз больше ДНК, чем у кишечной палочки. Сравнивая количество ДНК на клетку у эукариотических организмов, трудно уловить какие-либо корреляции между степенью сложности организма и количеством ДНК на ядро. Примерно одинаковое количество ДНК имеют такие различные организмы как лен, морской еж, окунь (1,4-1,9 пг) или рыба голец и бык (6,4 и 7 пг).

Значительны колебания количества ДНК в больших таксономических группах. Среди высших растений количество ДНК у разных видов может отличаться в сотни раз, так же, как и среди рыб, в десятки раз отличается количество ДНК у амфибий.

У некоторых амфибий в ядрах количество ДНК больше, чем в ядрах человека в 10-30 раз, хотя генетическая конституция человека несравненно сложнее, чем у лягушек. Следовательно, можно предполагать, что «избыточное» количество ДНК у более низко организованных организмов либо не связано с выполнением генетической роли, либо число генов повторяется то или иное число раз.

Таблица 4 . Содержание ДНК в клетках некоторых объектов (пг, 10 -12 г)

Разрешить эти вопросы оказалось возможным на основании изучения кинетики реакции ренатурации или гибридизации ДНК. Если фрагментированные молекулы ДНК в растворах подвергнуть тепловой денатурации, а затем инкубировать их при температуре несколько более низкой, чем та, при которой происходит денатурация, то идет восстановление исходной двуспиральной структуры фрагментов ДНК за счет воссоединения комплементарных цепей – ренатурация. Для ДНК вирусов и прокариотических клеток было показано, что скорость такой ренатурации прямо зависит от величины генома; чем больше геном, чем больше количество ДНК на частицу или клетку, тем больше нужно времени для случайного сближения комплементарных цепей и специфической реассоциации большего числа разных по нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (рис. 53). Характер кривой реассоциации ДНК прокариотических клеток указывает на отсутствие повторяющихся последовательностей оснований в геноме прокариот; все участки их ДНК несут уникальные последовательности, число и разнообразие которых отражает степень сложности генетической композиции объектов и, следовательно, их общей биологической организации.

Совсем другая картина реассоциации ДНК наблюдается у эукариотических организмов. Оказалось, что в состав их ДНК входят фракции, которые ренатурируют с гораздо более высокой скоростью, чем можно было бы предполагать на основании размера их генома, а также фракция ДНК, ренатурирующая медленно, подобно уникальным последовательностям ДНК прокариот. Однако для эукариот требуется значительно большее время для ренатурации этой фракции, что связано с общим большим размером их генома и с большим числом различных уникальных генов.

В той части ДНК эукариотов, которая отличается высокой скоростью ренатурации, различают две подфракции: 1) фракцию с высоко или часто повторяющимися последовательностями, где сходные участки ДНК могут быть повторены 10 6 раз; 2) фракцию умеренно повторяющихся последовательностей, встречающихся в геноме 10 2 -10 3 раз. Так, у мыши во фракцию ДНК с часто повторяющимися последовательностями входит 10% от общего количества ДНК на геном и 15% приходится на фракцию с умеренно повторяющимися последовательностями. Остальные 75% от всей ДНК мыши представлены уникальными участками, соответствующими большому числу различных неповторяющихся генов.

Фракции с часто повторяющимися последовательностями могут обладать иной плавучей плотностью, чем основная масса ДНК, и поэтому могут быть выделены в чистом виде, как так называемые фракции сателлитной ДНК . У мыши эта фракция имеет плотность, равную 1,691 г/мл, а основная часть ДНК - 1,700 г/мл. Эти различия плотности определяются различиями в нуклеотидном составе. Например, у мыши в этой фракции имеется 35% Г и Ц пар, а в основном пике ДНК - 42%.

Как оказалось, сателлитная ДНК, или фракция ДНК с часто повторяющимися последовательностями, не участвует в синтезе основных типов РНК в клетке, не связана с процессом синтеза белка. Этот вывод сделан был на основании того, что ни один из типов РНК клетки (тРНК, иРНК, рРНК) не гибридизируется с сателлитными ДНК. Следовательно, на этих ДНК нет последовательностей, отвечающих за синтез клеточных РНК, т.е. сателлитные ДНК не являются матрицами для синтеза РНК, не участвуют в транскрипции.

Существует гипотеза о том, что высокоповторяющиеся последовательности, не участвующие непосредственно в синтезе белков, могут нести информацию, играющую важную структурную роль в сохранении и функционировании хромосом. К ним могут быть отнесены многочисленные участки ДНК, связанные с белками остова интерфазного ядра (см. ниже), участки начала репликации или транскрипции, а также участки ДНК, регулирующие эти процессы.

Методом гибридизации нуклеиновых кислот прямо на хромосомах (in situ ) была изучена локализация этой фракции. Для этого на изолированной сателлитной ДНК с помощью бактериальных ферментов синтезировали меченую 3 Н-уридином РНК. Затем цитологический препарат с хромосомами подвергали такой обработке, при которой происходит денатурация ДНК (повышенная температура, щелочная среда и др.). После этого на препарат помещали меченную 3 Н РНК и добивались гибридизации между ДНК и РНК. Радиоавтографически было обнаружено, что большая часть метки локализуется в зоне первичных перетяжек хромосом, в зоне их центромерных участков. Метка обнаруживалась также и в других участках хромосом, но очень слабо (рис. 54).

За последние 10 лет сделаны большие успехи в изучении центромерных ДНК , особенно у дрожжевых клеток. Так у S. cerevisiae центромерная ДНК состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она состоит из двух консервативных участков (I и III) и центрального элемента (II), обогащенного АТ-парами оснований. Сходное строение ДНК центромеры имеют хромосомы дрозофилы. Центромерная ДНК человека (альфоидная сателлитная ДНК) состоит из тандема мономеров по 170 п.н., организованных в группы димеров или пентамеров, которые в свою очередь образуют большие последовательности по 1-6 х 10 3 п.н. Такая самая большая единица повторена 100-1000 раз. С этой специфической центромерной ДНК комплексируются особые центромерные белки, участвующие в образовании кинетохора , структуры, обеспечивающей связь хромосом с микротрубочками веретена и в движении хромосом в анафазе (см. ниже).

ДНК с высокоповторяющимися последовательностями обнаружена также в теломерных участках хромосом многих эукариотических организмов (от дрожжей до человека). Здесь чаще всего встречаются повторы, в которые входят 3-4 гуаниновых нуклеотида. У человека теломеры содержат 500-3000 повторов TTAGGG. Эти участки ДНК выполняют особую роль - ограничивать хромосому с концов и предотвращать ее укорачивание в процессе многократной репликации.

Недавно было найдено, что высокоповторяющиеся последовательности ДНК интерфазных хромосом связываются специфически с белками - ламинами, подстилающими ядерную оболочку, и участвуют в заякоревании растянутых деконденсированных интерфазных хромосом, тем самым определяют порядок в локализации хромосом в объеме интерфазного ядра.

Сделано предположение, что сателлитная ДНК может участвовать в узнавании гомологичных районов хромосом при мейозе. По другим предположениям, участки с часто повторяющимися последовательностями играют роль разделителей (спейсеров) между различными функциональными единицами хромосомной ДНК, например между репликонами (см. ниже).

Как оказалось, фракция умеренно повторяющихся (от 10 2 до 10 5 раз) последовательностей принадлежит к пестрому классу участков ДНК, играющих важную роль в процессах создания аппарата белкового синтеза. В эту фракцию входят гены рибосомных ДНК, которые могут быть повторены у разных видов от 100 до 1000 раз. В эту фракцию входят многократно повторенные участки для синтеза всех тРНК. Более того, некоторые структурные гены, ответственные за синтез определенных белков, также могут быть многократно повторены, представлены многими копиями. Такими являются гены для белков хроматина - гистонов, повторяющихся до 400 раз.

Кроме того, в эту фракцию входят участки ДНК с разными последовательностями (по 100-400 нуклеотидных пар), также многократно повторенными, но рассеянными по всему геному. Их роль еще не до конца ясна. Высказывается предположение, что такие участки ДНК могут представлять собой акцепторные или регуляторные участки разных генов.

Итак, ДНК эукариотических клеток гетерогенна по составу, содержит несколько классов последовательностей нуклеотидов: часто повторяющиеся последовательности (> 10 6 раз), входящие во фракцию сателлитной ДНК и не транскрибирующиеся; фракция умеренно повторяющихся последовательностей (10 2 -10 5), представляющих блоки истинных генов, а также короткие последовательности, разбросанные по всему геному; фракция уникальных последовательностей, несущая информацию для большинства белков клетки.

Исходя из этих представлений становятся понятными те различия в количестве ДНК, которые наблюдаются у разных организмов: они могут быть связаны с неодинаковой долей тех или иных классов ДНК в геноме организмов. Так, например, у амфибии Amphiuma (у которой ДНК в 20 раз больше, чем у человека) на долю повторяющихся последовательностей приходится до 80% от всей ДНК, у луков - до 70, у лосося - до 60% и т.п. Истинное же богатство генетической информации должна отображать фракция уникальных последовательностей. Не нужно забывать, что в нативной, нефрагментированной молекуле ДНК хромосомы все участки, включающие уникальные, умеренно и часто повторяющиеся последовательности, связаны в единую гигантскую ковалентную цепь ДНК.

Молекулы ДНК гетерогенны не только по участкам разной нуклеотидной последовательности, но и различны в отношении их синтетической активности.

Репликация эукариотических ДНК

Бактериальная хромосома реплицируется как одна структурная единица, имеющая одну стартовую точку репликации и одну точку терминации. Таким образом бактериальная циклическая ДНК является одним репликоном . От стартовой точки репликация идет в двух противоположных направлениях, так что по мере синтеза ДНК образуется так называемый глазок репликации, ограниченный с двух сторон репликационными вилками, что хорошо видн при электронномикроскопическом изучении вирусных и бактериальных реплицирующихся хромосом.

У эукариотических клеток организация репликации иного характера – полирепликоннная.. Как уже говорилось, при импульсном включении 3 НТ множественная метка появляется практически во всехмитотических хромосомах. Это означает, что одновременно в интерфазной хромосоме существует множество мест репликации и множество автономных точек начала репликации. Более подробно это явление было изучено с помощью радиоавтографии меченых молекул, выделенных ДНК (рис. 55).Если клетки были импульсно мечены 3 НТ, то в световом микроскопе на автографах выделенных ДНК можно видеть участки восстановленного серебра в виде пунктирных линий. Это небольшие отрезки ДНК, которые успели реплицироваться, а между ними расположены участки нереплицированной ДНК, которая не оставила радиоавтографа и поэтому остается невидимой. По мере увеличения времени контакта 3 НТ с клеткой величина таких отрезков возрастает, а расстояние между ними уменьшается. Из этих экспериментв можно точно рассчитать скорость репликации ДНК у эукариотических организмов. Скорость движения репликационной вилки оказалась равной 1-3 т.п.н. в мин у млекопитающих, около 1 т.п.н. в мин у некоторых растений, что намного ниже скорости репликации ДНК у бактерий (50 т.п.н. в мин.). В этих же экспериментах была прямо доказана полирепликонная структура ДНК хромосом эукариот: по длине хромосомной ДНК, вдоль нее, располагается множество независимых участков репликации – репликонов. По расстоянию между средними точками смежных метящихся репликонов, т.е. по расстоянию между двумя соседними стартовыми точками репликации, можно узнать величину отдельных репликонов. В среднем величина репликонову высших животных составляет около 30 мкм или 100 т.п.н. Следовательно, в гаплоидном наборе млекопитающих должно быть 20 000-30 000 репликонов. У низших эукариот величина репликонов меньше, около 40 т.п.н. Так у дрозофилы на геном приходится 3500 репликонов, а у дрожжей – 400. Как говорилось, синтез ДНК в репликоне идет в двух противоположных направлениях. Это легко доказывается радиоавтографически: если клеткам после импульсной метки дать продолжить синтезировать ДНК некоторое время в среде без 3 НТ, то произойдет падение включения его в ДНК, будет происходить как бы разбавление метки, и на радиоавтографе можно будет видеть симметричное, с двух сторон реплицируемого участка, уменьшение количества зерен восстановленного серебра.

Реплицирующиеся концы или вилки в репликоне прекращают движение, когда встретятся с вилками соседних репликонов (в терминальной точке, общей для соседних репликонов). В этом месте реплицированные участки соседних репликонов объединяются в единые ковалентные цепи двух новосинтезированных молекул ДНК. Функциональное подразделение ДНК хромосом на репликоны совпадает со структурным подразделением ДНК на домены или петли, основания которых, как уже упоминалось, скреплены белковыми связками.

Таким образом весь синтез ДНК на отдельной хромосоме протекает за счет независимого синтеза на множестве отдельных репликонов, с последующим соединением концов соседних отрезков ДНК. Биологический смысл этого свойства становится ясным при сравнении синтеза ДНК у бактерий и эукариот. Так бактериальная монорепликонная хромосома длиной в 1600 мкм синтезируется со скоростью около получаса. Если бы сантиметровая молекула ДНК хромосомы млекопитающих реплицировалась тоже как монорепликонная структура, то на это ушло бы около недели (6 суток). Но если в такой хромосоме расположено несколько сот репликонов, то для полной ее репликации понадобится всего около часа. На самом же деле время репликации ДНК у млекопитающих составляет 6-8 часов. Это связано с тем, что не все репликоны отдельной хромосомы включаются одновременно.

В некоторых случаях наблюдается одновременное включение всех репликонов или же появление дополнительных точек начала репликации, что дает возможность закончить синтез всех хромосом за минимально короткое время. Это явление происходит на ранних этапах эмбриогенеза некоторых животных. Так известно, что при дроблении яиц шпорцевых лягушек Xenopus laevis синтез ДНК занимает всего 20 минут, тогда как в культуре соматических клеток этот процесс продолжается около суток. Аналогичная картина наблюдается у дрозофилы: на ранних эмбриональных стадиях весь синтез ДНК в ядре занимает 3,5 минуты, а в клетках культуры ткани – 600 минут. При этом в клетках культуры величина репликонов оказалась почти в 5 раз больше, чем у эмбрионов.

Синтез ДНК по длине отдельной хромосомы происходит неравномерно. Было обнаружено, что в индивидуальной хромосоме активные репликоны собраны в группы, репликативные единицы, которые включают в себя 20-80 точек начала репликации. Это следовало из анализа радиоавтографов ДНК, где наблюдалась именно такая сблоченность реплицирующихся отрезков. Другим основанием для представления о существовании блоков или кластеров репликонов или репликационных единиц были эксперименты с включением в ДНК аналога тимидина - 5’-бромдезоксиуридина (BrdU). Включение BrdU в интерфазный хроматин приводит к тому, что во время митоза, участки с BrdU конденсируются в меньшей степени (недостаточная конденсация), чем те участки, где включался тимидин. Поэтому те участки митотических хромосом в которые включился BrdU, будут слабо окрашиваться при дифференциальной окраске. Это позволяет на синхронизированных культурах клеток выяснить последовательность включения BrdU, т.е. последовательность синтеза ДНК по длине одной взятой хромосомы. Оказалось, что происходит включение предшественника в большие участки хромосомы. Включение разных участков происходит строго последовательно в течение S-периода. Каждая хромосома характеризуется высокой стабильностью порядка репликации по своей длине, имеет свой специфический рисунок репликации.

Кластеры репликонов, объединенные в репликационные единицы, связаны с белками ядерного матрикса (см. ниже), которые вместе с ферментами репликации образуют т.н. кластеросомы – зоны в интерфазном ядре, в которых идет синтез ДНК.

Порядок, в котором активируются репликационные единицы, может, вероятно, определяться структурой хроматина в этих участках. Так, например, зоны конститутивного гетерохроматина (вблизи центромеры) реплицируются обычно в конце S-периода, также в конце S-периода удваивается часть факультативного гетерохроматина (например, X-хромосома самок млекопитающих). Особенно четко во времени последовательность репликации участков хромосом коррелирует с рисунком дифференциальной окраски хромосом: R-сегменты относятся к ранореплицирующимся, G-сегменты соответствуют участкам хромосом с поздней репликацией. C-сегменты (центромера) – места самой поздней репликации.

Так как в разных хромосомах величина и число разных групп дифференциально окрашенных сегментов различно, то это создает картину асинхронного начала и завершения репликации разных хромосом в целом. Во всяком случае, последовательность начала и окончания репликации отдельных хромосом в наборе не беспорядочная. Существует строгая последовательность репродукции хромосом относительно других хромосом в наборе.

Длительность процесса репликации отдельных хромосом прямо не зависит от их размеров. Так крупные хромосомы человека группы А (1-3) оказываются мечеными в течение всего S-периода, так же как и более короткие хромосомы группы В (4-5).

Таким образом, синтез ДНК в геноме эукариот начинается почти одновременно на всех хромосомах ядра в начале S-периода. Но при этом происходит последовательное и асинхронное включение разных репликонов как в разных участках хромосом, так и в разных хромосомах. Последовательность репликации того или иного участка генома строго детерминирована генетически. Это последнее утверждение доказывается не только картиной включения метки в разные отрезки S-периода, но также тем, что существует строгая последовательность появления в ходе S-периода пиков чувствительности определенных генов к мутагенам.