Функциональная геномика тесно соприкасается и фактически перекрывается с новейшим направлением биологии, получившим название "протеомика " - наука о протеомах. Слово "протеом" образовано от слова "протеин" (белок) и окончания слова "геном", так что в самом названии как бы слиты воедино «белок» и «геном» (ДНК). Это подчеркивает их теснейшую взаимосвязь. Однако, между геномикой и протеомикой, между геномом и протеомом есть одно фундаментальное различие, которое вызывает к жизни совершенно новые ме- тоды исследования, новые стратегии.

Протеом - понятие динамическое, тогда как геном стабилен и постоянен, иначе было бы невозможно передать наследственные свойства от поколения к поколению, обеспечить сохранение видов и т.д. Изменчивость генома всегда происходит на фоне его высокой стабильности и ни в коей мере ее не отменяет. Протеом - набор белков данной клетки в данной фазе ее развития в данный момент времени, т.е. меньше генома по общему объему информации. В любой клетке человеческого организма никогда не функционируют все примерно 80 тыс. генов, работает лишь их часть - иногда меньшая, иногда большая. Хотя точные цифры привести пока трудно, но в обычной специализированной клетке, например, в клетке печени или легкого, одновременно присутствуют, вероятно, не более 10 тыс. белков, причем, в резко различных количествах - от нескольких молекул на клетку до нескольких процентов общего клеточного белка. Набор белков постоянно меняется в зависимости от фазы клеточного деления, тканевой специализации клетки, стадии ее дифференцировки, принадлежности к нормальным или злокачественным клеткам, состояния стресса или покоя, воздействия внеклеточных физиологически активных веществ и так до бесконечности. Поэтому белковый "портрет" клетки зависит от множества факторов и воздействий, подвержен практически непрерывным изменениям, что делает его изучение особенно трудным.

Существует «букет» протеомных технологий; каждая имеет свои достоинства и недостатки. Остановимся на двух, наиболее эффективных. Сложную смесь белков, экстрагированных из клетки, можно подвергнуть разделению на носителе (обычно это полиакриламидный гель) в двух направлениях: в одном-белки будут делиться по размерам (молекулярной массе), в другом - по электрическому заряду (изоэлектрической точке). В результате, получается двумерная, карта, содержащая многие сотни точек, каждая из которых соответствует одному или нескольким белкам.

Если исследователя интересует какая-то группа белков, можно ее выделить на «карте» и подвергнуть повторному разделению в несколько измененных условиях с более высоким разрешением. Сейчас в банках данных хранится информация о множестве разных типов клеток, белки которых были подвергнуты электрофоретическому разделению в двух направлениях. Компьютер умеет сравнивать такие двумерные «белковые карты» и вычленять то, что у этих типов клеток одинаково, а по каким белкам они различаются.

Метод «двумерных карт» непрерывно совершенствуется, и большинство индивидуальных белковых точек, которые видны на этих «картах», уже идентифицированы или находятся в процессе идентификации.

Наиболее современный метод идентификации белков состоит в том, что исследуемый белок подвергают расщеплению на фрагменты (пептиды) с помощью того или иного фермента (протеазы). Затем полученные пептиды разделяют, обычно с помощью хроматографии под высоким давлением, а потом каждый из индивидуальных пептидов помещают в масс-спектрометр и узнают его массу. Сравнение полученных результатов с имеющимися в базах данных по белкам позволяет надежно опознать белок, если его структура известна. Для неизвестного белка этот метод помогает найти "родственников", а следовательно, сформулировать предварительное представление о его возможной функции.

Изменчивость протеома связана не только с тем, что в данный момент времени работает одна часть генов, а в другой момент - иная. Набор белков сильно зависит от процессов, протекающих на пути от ДНК к матричной РНК (мРНК). Здесь большая часть первичных генных продуктов (РНК) подвергается так называемому «альтернативному сплайсингу», суть которого состоит в том, что до образования зрелой матричной РНК из нее удаляются разные части молекулы. В результате, один ген может породить множество белков, различающихся первичной структурой. Таким образом, стало очевидно, что одна из старых догм биохимии и молекулярной биологии - "Один ген - один фермент" - нуждается в модернизации. Для очень многих случаев справедлива формула: "Один ген - много белков".

В этой связи, необходимо отметить, что после синтеза, белки претерпевают множество химических изменений (модификаций), которые создают их огромное разнообразие, хотя исходно они кодированы одним геном. К числу таких модификаций относятся реакции фосфорилирования, ацетилирования, метилирования, гликозилирования и многие другие. Если учесть, что на большом белке есть множество мест, где эти модификации могут происходить, то легко себе представить, какое практически бесконечное разнообразие форм одной и той же белковой молекулы может возникнуть. Подавляющее большинство модификаций существенно сказывается на биологической активности данной молекулы белка, а также на ее способности взаимодействовать с другими белковыми молекулами. В итоге, мы приходим к заключению, что когда в клетке работает, скажем 10% всех генов – допустим, 8 тыс., - то количество разных белков может превысить эту величину в 10 раз. Исследователи и раньше догадывались, что такая ситуация возможна, однако, только теперь реально представляют ее истинные масштабы.

Крайне важным разделом протеомики, безусловно, следует считать изучение белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий. В течение жизни клетки практически каждый белок при своем функционировании взаимодействует с множеством макромолекул, а также низкомолекулярных лигандов.

Для изучения белок-белковых взаимодействий в последние годы получил широчайшее распространение метод так называемых «дрожжевых двойных гибридов». С помощью генной инженерии создается конструкция, которая состоит из участка ДНК, взаимодействующего с фактором транскрипции, и участка ДНК, кодирующего «ген-репортер», который в свою очередь кодирует белок-фермент, активность которого легко измерить. Фактор транскрипции состоит из двух доминантов и работает только в том случае, когда доминанты взаимодействуют друг с другом. Если надо узнать, взаимодействуют ли два исследуемых белка друг с другом, нужно отчленить фактор транскрипции и к каждому из доминантов присоединить по интересующему нас белку. При их взаимодействии фактор транскрипции восстановит свою активность, что позволит работать «гену-репортеру», и тогда вы обнаружите активность «репортерного белка». Если исследуемые белки не взаимодействуют, белок-фермент не образуется.

Применение двугибридной системы к белкам человека и других организмов позволило доказать, что существует огромное число белок-белковых контактов самого разного типа и, кроме того, обнаружить множество ранее неизвестных белок-белковых взаимодействий. Эта информация исключительно важна для идентификации компонентов сигнальных путей в клетке. Как правило, в передаче сигналов от поверхности клетки к ядру участвуют «белки-посредники», часто находящиеся в клетке в ничтожных концентрациях, поэтому анализ сигнальных путей для экспериментаторов сильно затруднен. Выявление белок-белковых взаимодействий резко изменило ситуацию.

При анализе белок-нуклеиновых взаимодействий широко используют методы «химической сшивки» этих компонентов (например, сотрудниками академика А.А. Богданова выявлены многие важные взаимодействия внутри рибосомных частиц, где осуществляется биосинтез белков в клетке).

Другой удобный метод - изменение электрофоретической подвижности при комплексообразовании, с помощью которого проанализировано множество ДНК-белковых и РНК-белковых контактов. Оригинальный вариант этого метода в сочетании с «химической сшивкой» разработан академиком А.Д. Мирзабековым и применен для раскрытия структуры нуклеосомы - элементарной структурной единицы, состоящей из ДНК и белков-гистонов, из которых построены все хромосомы.

Протеомика - функциональная наука, основным предметом изучения которой является протеом. Протеом представляет собой весь набор белков, которые продуцируются или модифицируются организмом или системой. Протеомика - это наука, изучающая виды белка, а потому она помогла открыть множество новых видов этого соединения - гораздо больше, чем было известно до ее возникновения как науки. Количество белков, как оказалось, зависит от времени и различных требований или стрессов, которым подвергаются клетки или организмы. Протеомика - это междисциплинарная область, которая в значительной степени предопределена новейшими проектами по изучению генома. Она охватывает исследование протеомов из общего уровня белкового состава, структуры и активности. Функциональная протеомика часто называется самым важным компонентом функциональной геномики.

Предмет исследования

Дать определение протеомики не так просто, как может показаться на первый взгляд. Эта наука обычно подразумевает крупномасштабный экспериментальный анализ белков и протеомов, но часто используется для изучения возможностей очистки белков.

После геномики и транскриптомики протеомика является следующим шагом в изучении биологических систем. Она гораздо сложнее, чем геномика, потому что геном организма более или менее постоянен, тогда как протеом отличается от клетки к клетке и время от времени. Отдельные гены экспрессируются в разных типах клеток, а это означает, что даже основной набор белков, которые продуцируются в клетке, необходимо идентифицировать.

История изучения

Протеомика изучения структуры белков - направление в биохимии, выделившееся относительно недавно. В прошлом исследования белков проводились с помощью анализа РНК, но оказалось, что структура РНК никак не коррелирует с содержанием белка. Известно, что мРНК не всегда транслируется в белок, а количество белка, продуцируемого для данного количества мРНК, зависит от того, какой ген транскрибируется, а также от текущего физиологического состояния клетки. Протеомика - это наука, которая подтверждает наличие белка и обеспечивает прямую оценку присутствующего количества.

Последующие изменения

Мало того, что извлечение белка с мРНК вызывает его повреждение, но, кроме того, многие белки также подвергаются широкому спектру химических модификаций после этого процесса. Многие из этих посттрансляционных модификаций имеют решающее значение для функции белка.

Фосфорилирование

Одной из таких модификаций является фосфорилирование, которое происходит со многими ферментами и структурными белками в процессе клеточной передачи сигналов. Добавление фосфата к определенным аминокислотам, чаще всего серинам и треонину, опосредуемым серин / треонинаминазами или реже тирозином, опосредованным тирозинкиназами, заставляет молекулу белка стать мишенью для связывания или взаимодействия с различным набором других молекул, которые распознают фосфорилированный домен.

Поскольку фосфорилирование белка является одной из наиболее изученных его модификаций, многие «протеомические» усилия направлены на определение набора фосфорилированных белков в конкретной клетке или тканевом типе при определенных обстоятельствах.

Убиквитинирование

Убиквитин представляет собой небольшой белок, который может быть прикреплен к определенным субстратам ферментами, по-научному называемыми E3 ubiquitin-ligases. Определение того, какие белки являются поли-убиквитинированными, помогает понять, как регулируется движение молекул этого вещества. Аналогичным образом, как только исследователь определяет, какие субстраты убиквитированы каждой лигазой, полезно определить набор лигаз, выраженных в конкретном типе клеток.

Дополнительные изменения

Помимо фосфорилирования и убиквитинирования, белки могут быть подвергнуты (в частности) метилированию, ацетилированию, гликозилированию, окислению и нитрозилированию. Некоторые белки подвергаются всем этим изменениям, часто в зависящих от времени комбинациях. Это иллюстрирует потенциальную сложность изучения структуры и функции белка.

Отдельные белки производятся в разных условиях. Клетка может создавать разные наборы белков в разное время или в разных условиях, например, во время развития, клеточной дифференциации, клеточного цикла или канцерогенеза. Дальнейшее увеличение сложности протеома, как уже упоминалось, подразумевает, что большинство белков могут подвергаться широкому спектру посттрансляционных модификаций.

Поэтому исследования в области протеомики - это в перспективе сложная задача, даже если тема изучения этой науки по-прежнему будет ограниченной. При более амбициозных задачах, например, когда ищут биомаркер для конкретного подтипа рака, ученый-протеомист может выбрать изучение нескольких образцов сыворотки крови у нескольких пациентов с раком, чтобы свести к минимуму смешивающие факторы. Таким образом, сложные экспериментальные конструкции иногда необходимы для учета динамической сложности протеома.

Отличия от геномики

Протеомика дает разные уровни понимания, чем геномика по многим причинам:

1. Уровень транскрипции гена дает лишь приблизительную оценку его уровня трансляции в белок. Полученную в изобилии мРНК можно быстро деградировать или трансформировать не самым эффективным образом, в результате чего образуется небольшое количество белка.
2. Как упомянуто выше, многие белки испытывают посттрансляционные модификации, которые сильно влияют на их функциональность. Например, некоторые белки не активны до тех пор, пока не станут фосфорилированными. Методы, такие как фосфопротеомика и гликопротеомика, используются для изучения посттрансляционных модификаций.
3. Многие транскрипты приводят к появлению более одного белка, путем альтернативного сращивания или альтернативных посттрансляционных модификаций.
4. Многие белки образуют комплексы с другими белками или молекулами РНК и действуют только в присутствии этих других молекул. Степень деградации белка играет важную роль в его содержании.

Воспроизводимость

Одним из основных факторов, влияющих на воспроизводимость экспериментов в протеомике, является одновременное элюирование многих других пептидов, которые могут быть измерены масс-спектрометрами. Это приводит к стохастическим различиям между экспериментами из-за зависящего от данных приемов триптических пептидов. Хотя ранние крупномасштабные анализы протеома дрожжей показали значительную изменчивость в результатах между различными лабораториями, по-видимому, частично из-за технических и экспериментальных различий между ними, воспроизводимость была улучшена в более позднем масс-спектрометрическом анализе, особенно при использовании масс-спектрометров.

Методы исследования

В протеомике существует множество методов изучения белков. Как правило, они могут быть обнаружены с использованием антител (иммунологических анализов) или при помощи масс-спектрометрии. Если анализируется сложный биологический образец, необходимо либо использовать очень специфическое антитело в количественном метоп-блот-анализе (qdb), либо биохимическое разделение.

Обнаружение белка с помощью антител (иммунологических анализов)

Антитела к конкретным белкам или их модифицированным формам использовались в исследованиях биохимии и клеточной биологии. Они относятся к числу наиболее распространенных инструментов, используемых сегодня молекулярными биологами. Существует несколько конкретных методов и протоколов, которые предплагают использование антител для обнаружения белка. В течение десятилетий фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) использовался для их обнаружения и количественного измерения в образцах биологического вещества. Вестерн-блот может быть использован для обнаружения и количественного определения отдельных белков, где на начальном этапе сложную органическую смесь разделяют с использованием SDS-PAGE, а затем интересующий белок идентифицируют с использованием антитела.

Модифицированные белки могут быть изучены путем разработки антитела, специфичного для этой модификации. Например, существуют антитела, которые только распознают определенные белки, когда они являются тирозинфосфорилированными, известными как фосфоспецифические антитела. Кроме того, существуют антитела, специфичные для других модификаций. Они могут быть использованы для определения набора белков, подвергнувшихся модификации.

Протеомика в медицине

Обнаружение заболеваний на молекулярном уровне является движущей силой новой революции в области диагностики и лечения. Технология цифрового иммуноанализа улучшила чувствительность обнаружения молекул до так называемого аттомолярного диапазона. Эта возможность дает нам потенциал для открытия новых достижений в области диагностики и терапии, но такие технологии были отнесены к ручным процедурам, которые не очень хорошо подходят для эффективного ежедневного использования.

Хотя обнаружение белка с антителами все еще очень распространено в молекулярной биологии, были разработаны и другие методы, которые не полагаются на антитело. Эти методы предлагают различные преимущества, например, они часто могут определять последовательность белка или пептида, они могут иметь более высокую пропускную способность, чем антитело, и иногда они могут идентифицировать и количественно определять белки, для которых не существует антител.

Методы протеомики

Одним из самых ранних методов анализа белка была деградация Эдмана (введена в 1967 году), где один пептид подвергается нескольким стадиям химического разложения, чтобы определить его последовательность. Эти методы в основном были вытеснены технологиями, которые обеспечивают более высокую пропускную способность. От методов зависят и различные направления протеомики.

Основные методы разделения

Для анализа сложных биологических образцов требуется снижение их сложности. Это можно выполнить сделать с помощью одномерного или двухмерного разделения. Совсем недавно были разработаны онлайн методы, в которых индивидуальные пептиды были разделены с использованием хроматографии с обращенной фазой, а затем непосредственно ионизированы с использованием метода ESI.

Гибридные технологии

Существует несколько гибридных технологий, которые используют очистку отдельных аналитов на основе антител, а затем проводят масс-спектрометрический анализ для их идентификации и количественной оценки. Примерами этих методов являются метод MSIA (масс-спектрометрический иммуноанализ), разработанный Рэндалом Нельсоном в 1995 году, и метод SISCAPA (стабильный изотопный стандартный захват с антипептидными антителами), введенный Ли Андерсоном в 2004 году.

Сравнительный протеомический анализ может выявить роль белков в сложных биологических системах, включая размножение. Например, лечение инсектицидом триазофосом приводит к увеличению содержания коричневых саженцев (Nolaparvata lugens (Stål)) - мужских вспомогательных железных белков (Acps), которые могут быть переданы самкам посредством спаривания, что приводит к увеличению фертильности (т.е. плодовитости) женщин. Чтобы выявить изменения в типах белков вспомогательных желез (Acps) и репродуктивных белков, полученных от самцов кузнечиков, исследователи провели сравнительный протеомический анализ спящих самцов вида N. lugens. Результаты показали, что эти белки участвуют в репродуктивном процессе взрослых самок и самцов кузнечиков N. lugens.

Высокопроизводительные протеомические технологии

Протеомика - это наука, которая неуклонно набирала обороты в течение последнего десятилетия. Многие из подходов, разработанных этой наукой, абсолютно революционны, некоторые же основываются на старых научных методах. Методы на основе масс-спектрометрии и микроячейки являются наиболее распространенными технологиями для крупномасштабного изучения белков.

Масс-спектрометрия и профилирование

В настоящее время для профилирования белка используются два метода масс-спектрометрии. Более известный и широко распространенный метод использует двумерный электрофорез с высоким разрешением для разделения белков из разных образцов параллельно с последующим отбором и окрашиванием дифференцированных экспрессированных белков, которые должны быть идентифицированы с помощью масс-спектрометрии. Несмотря на достижения в 2DE и общей проработанности этого метода, он также имеет свои пределы. Основной проблемой является неспособность идентифицировать все белки в образце, учитывая их вариативность и прочие уникальные свойства.

Второй количественный подход использует стабильные метки изотопа для дифференцированных меток белков из двух различных сложных смесей. Здесь белки в сложной смеси сперва помечаются изотопами, а затем расщепляются с получением меченых пептидов. Затем меченые смеси объединяют, причем пептиды разделяют многомерной жидкостной хроматографией и анализируют с помощью тандемной масс-спектрометрии. Изотопно-кодированные метки (ICAT) представляют собой широко используемые изотопные метки. В этом научном методе цистеиновые остатки белков ковалентно присоединяются к реагенту ICAT, тем самым снижая сложность смесей, исключающих остатки, отличные от цистеина.

Протеомика, геномика, метаболомика - новые направления в биологии, отличающиеся сложностью и инновационностью. Далеко не каждому под силу их изучение.

Итак, главной задачей протеомики является выявление механизма взаимодействия огромного числа белков и пептидов в одном организме. Какова же практическая значимость этой грандиозной и дорогостоящей работы? Очевидно, что в первую очередь в результатах такой работы заинтересованы фармакологи и медики, поскольку очень часто прослеживается тесная связь между изменениями в белковом составе и болезненным состоянием человека. Поэтому новые данные в протеомике будут использоваться (и уже используются) для быстрой разработки новых лекарственных средств и новейших методов лечения болезней, с которыми медицина боролась веками. На сегодняшний день 95% всех фармакологических средств воздействуют на белки. Протеомика со своим системным подходом может помочь идентифицировать и оценить важность появления новых белков гораздо эффективнее, что, в свою очередь, ускорит разработку новых диагностических тестов и терапевтических средств.

Первое практическое применение протеомных исследований состоялось задолго до появления термина "протеомика", еще в начале XX в., когда была обнаружена роль инсулина в развитии такого тяжелого заболевания, как диабет. Создание инсулиновых препаратов спасло жизнь миллионам людей.

В настоящее же время протеомика, вместе с геномикой и биоинформатикой, ориентирована на создание новых лекарственных препаратов (рис.18), в которых молекулярными мишенями будут служить те или иные белки . Процесс нахождения новых мишеней для действия лекарств решается с помощью биоинформатики, причем объектом анализа является геном. Однако после анализа генома необходимо получить доказательства того, что данный белок интенсивно экспрессируется и находится в клетке в рабочем состоянии. Эту задачу решает протеомика. Таким образом выявляется молекулярная генетическая мишень для лекарства.

Рис.18.

Следует отметить, что протеомика может и сама по себе решать проблему нахождения мишени. Если получить протеомные карты (подобные тем, что представлены на рис.3 или 4) нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики. Можно предположить, что в будущем к обычному анализу крови добавится создание протеомных карт крови. Для этого в поликлиниках необходимо будет использовать специальное оборудование, с помощью которого у пациентов периодически будут брать кровь. При возникновении болезненного состояния протеомную карту больного человека нужно будет всего лишь сравнить с его же протеомной картой, но составленной в то время, когда он был здоров, и можно будет выявить произошедшие изменения в белковом составе крови и определить причину заболевания. Подобное сравнение протеомов опухолевых и нормальных клеток, клеток до и после воздействия определенных факторов (например, физических или химических), использование биологических жидкостей в диагностических целях - все это представляет огромный интерес и открывает совершенно новые перспективы для медицины, ветеринарии, фармакологии, пищевой промышленности и других прикладных областей. Впереди предстоит огромная и интересная работа.

протеомика биологическая наука

) — наука, изучающая белковый состав биологических объектов, а также модификации и структурно-функциональные свойства белковых молекул.

Описание

Протеомный анализ направлен на одновременное изучение многих индивидуальных , совокупность которых составляет определенную систему, что характеризует исследуемый объект в целом. Предметом изучения протеомики являются синтез, модификация, декомпозиция и замена белков исследуемого объекта. После расшифровки человека и геномов многих других организмов появились исчерпывающие базы данных о структуре всех белков человека и многих других организмов, а также их протеолитических фрагментов, полученных в стандартных условиях, что позволяет идентифицировать белки по молекулярной массе их протеолитических фрагментов. Развитие протеомики обусловлено использованием высокотехнологичных методов, позволяющих определить количество того или иного белка в образце, идентифицировать белок, его первичную структуру и пост-трансляционные модификации. В настоящее время большая часть работ в протеомике выполняется с использованием метода 2-D PAGE (двумерного -электрофореза в полиакриламиде). Однако в последнее десятилетие получают все более широкое применение высокотехнологичные методы, обладающие большей эффективностью, информативностью и чувствительностью, такие, как микросеквенирование белков, высокоэффективная жидкостная хроматография, а также использование белковых чипов с различными типами детекции, таких, как SELDI Protein Chip. Белковые чипы основаны на связывании определенных белков со специфически взаимодействующими или связывающимися с ними молекулами. Взаимодействие может строиться по типу антиген– , –лиганд, белок–белок, –субстрат или белок– . Чипы считываются и идентифицируются с помощью . В настоящее время в медицине применение методов протеомного анализа позволяет выявить маркеры сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний на ранней стадии заболевания (клиническая протеомика). Клиническая протеомика - это идентификация и количественное определение всех индивидуальных белков, которые содержатся в биологическом образце (сыворотка крови, спинномозговая жидкость, моча, ткань) и мониторинг изменения их концентраций. Методы протеомного анализа позволяют проанализировать до 10 000 индивидуальных белков в одном образце и зафиксировать изменения их концентраций, что позволяет проводить диагностику и мониторинг течения заболевания.

Авторы

• Народицкий Борис Савельевич
• Ширинский Владимир Павлович
• Нестеренко Людмила Николаевна

Источники

1. Арчаков А.И. Биоинформатика, геномика и протеомика - науки о жизни XXI столетия // Вопросы медицинской химии. 2000. №1. - http://medi.ru/pbmc/8800101.htm (дата обращения: 12.10.2009).
2. Conrotto P., Souchelnytskyi S. Proteomic approaches in biological and medical sciences: principles and applications // Exp. Oncol. 2008. V. 30, №3. P. 171–180.
3. Reddy G., Dalmasso E. A. SELDI ProteinChip® Array Technology: Protein-Based Predictive // Medicine and Drug Discovery Applications. Biomed Biotechnol. 2003. V. 4. P. 237–241.