Пептидная связь имеет свойства частично двойной связи. Это проявляется в уменьшении длины этой связи (0,132 нм) по сравнению с длиной простой связи C N (0,147 нм). Частично двоесвязный характер пептидной связи делает невозможным свободное вращение заместителей вокруг нее, поэтому пептидная группировка является плоской и имеет обычно транс-конфигурацию (ф-ла I). Tаким образом, остов пептидной цепи представляет собой ряд жестких плоскостей с подвижным ("шарнирным") сочленением в месте, где расположены асимметричные атомы С (в ф-ле I обозначены звездочкой).

В растворах пептидов наблюдается предпочтительное образование определенных конформеров. С удлинением цепи более выраженную устойчивость приобретают (аналогично белкам) упорядоченные элементы вторичной структуры. Образование вторичной структуры особенно характерно для регулярных пептидов, в частности для полиаминокислот.

Свойства

Олигопептиды по свойствам близки к аминокислотам, полипептиды подобны белкам. Олигопептиды представляют собой, как правило, кристаллические вещества, разлагающиеся при нагревании до 200 300 0 C. Они хорошо растворимы в воде, разбавленных кислотах и щелочах, почти не растворимы в органических растворителях. Исключения составляют олигопептиды, построенные из остатков гидрофобных аминокислот.

Олигопептиды обладают амфотерными свойствами и, в зависимости от кислотности среды, могут существовать в форме катионов, анионов или цвиттер-ионов. Основные полосы поглощения в ИК спектре для группы NH 3300 и 3080 см -1 , для группы C=O 1660 см -1 . В УФ спектре полоса поглощения пептидной группы находится в области 180-230 нм. Изоэлектрическая точка (рI) пептидов колеблется в широких пределах и зависит от состава аминокислотных остатков в молекуле. Величины рК а пептидов составляют для а-СООН ок. 3, для -H 2 ок. 8.

Химические свойства олигопептидов определяются содержащимися в них функциональными группами, а также особенностями пептидной связи. Их химические превращения в значительной мере аналогичны соответствующим реакциям аминокислот. Они дают положительную биуретовую реакцию и нингидриновую реакцию. Дипептиды и их производные (особенно эфиры) легко циклизуются, превращаясь в дикетопиперазины. Под действием 5,7 нормальной соляной кислоты пептиды гидролизуются до аминокислот в течение 24ч при 105 0 C.

Синтез пептидов

В пептидном синтезе используются известные из органической химии реакции получения амидов и специально разработанные методы для синтеза пептидов. Для успешного осуществления этих синтезов необходимо активировать карбоксильную группу, т.е. увеличить электрофильность карбонильного углерода. Это достигается путем химической модификации карбоксильной группы аминокислот. Тип такой модификации обычно определяет название метода пептидного синтеза.

1. Хлорангидридный метод.

В основе метода лежит реакция получения амидов взаимодействием хлорангидридов кислот с соответствующими аминами. Именно этим способом были получены первые пептиды. В настоящее время этот метод применяется крайне редко, поскольку он сопровождается образованием побочных продуктов и рацемизацией пептидов.

2. Азидный метод

Исходным веществом в данном способе чаще всего является этиловый эфир N-защищенной аминокислоты, из которой получают гидразид, последний превращают с помощью нитрита натрия в присутствии соляной кислоты в азид кислоты. В реакции обычно применяют гидразин, у которого один из азотов заблокирован защитной группой (Z-карбобензокси- или карботретбутилоксигруппа), что позволяет избежать образования побочных дигидразидов. Азиды при взаимодействии с С-защищенными аминокислотами в мягких условиях образуют пептиды.

Рацемизация в этом методе сведена к минимуму, однако могут протекать побочные реакции, а именно: азиды могут перегруппировываться в изоцианаты, которые в свою очередь при взаимодействии со спиртом, используемым в качестве растворителя, образуют уретаны.

3. Смешанные ангидриды

Широкое применение в пептидном синтезе нашли смешанные ангидриды аминокислот с производными угольной кислоты, получаемые, например, с помощью изобутилхлоркарбоната:

Реакцию в этом синтезе проводят при низкой температуре (-10..-20 С), достаточно быстро, что значительно снижает возможность образования побочных продуктов и рацемизации. Быстрый ступенчатый синтез пептидов с использованием смешанных ангидридов носит название REMA-синтез. Методы образования с использованием смешанных ангидридов широко применяются в твердофазном синтезе пептидов.

Таким образом, проведение пептидного синтеза требует учета и жесткого соблюдения некоторых факторов. Так, с целью снижения образования побочных продуктов и рацемизации, рекомендуются следующие типовые условия проведения реакции образования пептидной связи:

1)процесс необходимо проводить при низких температурах, время реакции должно быть минимальным;

2)реакционная масса должна иметь рН, близкую к нейтральной;

3) в качестве кислотосвязывающих реагентов используют органические основания, как пиперидин, морфолин и т.д;

4) проведение реакции желательно в безводных средах.

Твердофазный синтез

Твердофазный синтез - методический подход к синтезу олигомеров (полимеров) с использованием твердого нерастворимого носителя , представляющего собой органический или неорганический полимер.

В начале 60-х годов был предложен новый подход к решению проблем выделения и очистки, возникающих в пептидном синтезе. Позже автор открытия этого подхода, Р.Б. Меррифилд, в своей Нобелевской лекции рассказал, как это произошло: “Однажды у меня возникла мысль о том, как может быть достигнута цель более эффективного синтеза пептидов. План состоял в том, чтобы собирать пептидную цепь постадийно, причем во время синтеза цепь должна быть одним концом привязана к твердому носителю”. В результате выделение и очистка промежуточных и целевых производных пептидов сводились просто к фильтрованию и тщательной промывке твердого полимера для удаления всех избыточных реагентов и побочных продуктов, остающихся в растворе. Такая механическая операция может быть выполнена количественно, легко стандартизируется и может быть даже автоматизирована. Рассмотрим эту процедуру более подробно.

Министерство образования и науки Российской Федерации

ФГАОУ ВПО «Уральский федеральный университет имени первого президента России Б. Н. Ельцина»

Кафедра технологии органического синтеза

Реферат на тему: « Принципы и методы твердофазного синтеза. Синтез пептидов »

Выполнила студент гр. Х-300803

Шайхутдинова А.И.

Проверила Берсенева В.С.

Екатеринбург 2013

1. Введение…………………………………………………………………………3

2. Что такое пептиды?..........................................................................................4

2.1. Строение пептидов……………………………………………………….5

2.2. Синтез пептидов………………………………………………………….7

3. Твердофазный синтез пептидов……………………………………………10

3.1. Метод Мерринфилда……………………………………………………10

3.2. Твердая подложка……………………………………………………….14

3.3. Выбор подложки………………………………………………………...14

3.4. Линкеры………………………………………………………………….16

4. Первый синтез природного гормона – окситоцина……………………….22

5. Синтез инсулина в клетке…………………………………………………..30

6. Заключение…………………………………………………………………..34

7. Литература…………………………………………………………………...35

Введение

В органической химии нет ни одной реакции, обеспечивающей на практике количественные выходы целевых продуктов в любом случае. Единственное исключение составляет, по-видимому, полное сжигание органических веществ в кислороде при высокой температуре до СО 2 и Н 2 О. Поэтому очистка целевого продукта является сложной и трудоемкой задачей. Например, 100%-ная очистка продуктов пептидного синтеза является трудноразрешимой проблемой. Действительно, первый полный синтез пептида, гормона окситоцина (1953 г), содержащего всего 8 аминокислотных остатков, рассматривался как выдающееся достижение, принесшее его автору, В. дю Виньо, Нобелевскую премию 1955 г. Однако уже в следующие двадцать лет синтезы полипептидов подобной сложности превратились в рутину, так что в настоящее время синтез полипептидов, состоящих из 100 и более аминокислотных остатков, уже не рассматривается как непреодолимо трудная задача.

Цель работы: разобрать и объяснить: «Что вызвало столь драматические изменения в области синтеза полипептидов?»

Что же такое пептиды?

Пептиды- природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатков альфа-аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O) NH. Могут содержать в молекуле также неаминокислотную компоненту (напр., остаток углевода ). По числу аминокислотных остатков, входящих в молекулы пептидов, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Пептиды, содержащие до 10 аминокислотных остатков, называются олигопептидами, содержащие более 10 аминокислотных остатков полипептидами Природные полипептиды с молекулярной массой более 6 тыс. называются белками .

Впервые пептиды были выделены из ферментативных гидролизатов белков. Термин "пептиды" предложен Э. Фишером. Первый синтетический пептид получил T. Курциус в 1881г. Э. Фишер к 1905 разработал первый общий метод синтеза пептидов и синтезировал ряд олигопептидов различного строения. Существующий вклад в развитие химии пептидов внесли ученики Э. Фишера Э. Абдергальден, Г. Лейке и M. Бергман. В 1932 г. M Бергман и Л. Зервас использовали в синтезе пептидов бензилоксикарбонильную группу (карбобензоксигруппу) для защиты альфа-аминогрупп аминокислот, что ознаменовало новый этап в развитии синтеза пептидов. Полученные N-защищенные аминокислоты (N-карбобензоксиаминокислоты) широко использовали для получения различных пептидов, которые успешно применяли для изучения ряда ключевых проблем химии и биохимии этих веществ, например, для исследования субстратной специфичности протеолитических ферментов. С применением N-карбобензоксиаминокислот были впервые синтезированы природные пептиды(глутатион, карнозин и др.). Важное достижение в этой области разработанный в начале 50-х гг. P. Воганом и др. синтез пептидов методом смешанных ангидридов.

В 1953 В. Дю Виньо синтезировал первый пептидный гормон -окситоцин. На основе разработанной P. Меррифилдом в 1963 концепции твердофазного пептидного синтеза были созданы автоматические синтезаторы пептидов. Получили интенсивное развитие методы контролируемого ферментативного синтеза пептидов. Использование новых методов позволило осуществить синтез гормона инсулина и др.

Успехи синтетической химии пептидов были подготовлены достижениями в области разработки таких методов разделения, очистки и анализа пептидов, как ионообменная хроматография, электрофорез на различных носителях, гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), иммуно-химический анализ и др. Получили большое развитие также методы анализа концевых групп и методы ступенчатого расщепления пептидов. Были, в частности, созданы автоматические аминокислотные анализаторы и автоматические приборы для определения первичной структуры пептидов-так называемых секвенаторы.

Использование: в химии пептидов при синтезе пептидных цепей, содержащих гистидин и серин. Сущность изобретения: способ твердофазного синтеза пептидов общей ф-лы 1, включающий присоединение N-защищенных концевых аминокислот к инертному твердому носителю, последующее добавление N-защищенных аминокислот к наращиваемой пептидной цепи, причем боковую цепь остатка серина временно защищают группой, лабильной по отношению к агентам, используемым для удаления альфа-аминозащитных групп, а боковую цепь гистидина, если она присутствует, защищают группой, лабильной по отношению к альфа-аминодеблокирующему агенту; удалением в конце каждого цикла защитной группы, отщеплением полипептида от носителя с использованием аминолиза или аммонолиза, выделением образующегося соединения I. Ф-ла I: R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 -heu-R 5 -Pro-R 6 , где R 1 -пиро -Glu, N-AcDNal; R 2 His, DpClPhe, DpFPho, R 3 = Тгр, Д-Тгр; R 4 = DNal(2), Dh Arg(Et) 2 Dh Агд(Bu), Dh Arg(CH 2 CF 3) 2 R 5 = Агд, L-Arg(Et) 2 L-hАгд(Bu), L-hArg(CH 2 CF 3) 2 R 6 GlyNH 2 DAla NH 2

Изобретение относится к твердофазному синтезу аналога гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (ЛН-рилизинг гормона), путем метода минимальной защиты. Аналоги ЛГ-рилизинг гормона (далее упоминается как ЛГ-РГ) представляют собой нона- или декапептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ и проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-PГ. Аналоги являются предметом широкого клинического исследования вследствие их продемонстрированной способности облегчать симптомы эндометриоза, рака предстательной железы, преждевременного полового созревания и других гормонально-опосредованных заболеваний. Несмотря на то, что определенные аналоги ЛГ-РГ в настоящее время пригодны для терапевтического использования, их синтез является сложным процессом, а следовательно, и дорогостоящая методика их получения повышает стоимость аналогов, так необходимых при лечении. Аналоги ЛГ-РГ традиционно описываются либо как агонисты, либо как антагонисты, в зависимости от образа их действия. Аналоги ЛГ-РГ в соответствии с изобретением представляют собой нона- и декапептиды и включают как агонистов, так антагонистов. Примерами агонистов ЛГ-РГ, являющихся пригодными в настоящем изобретении, могут стать нафарелин, лейпрорелин, бусерелин, госерелин, гистерелин, трипторелин, и деслорелин, причем они отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения замещением остатка глицина в положении 6 D-аминокислотой. Синтетические агонисты имеют заодно с гормоном природного происхождения, гистидин в положении 2, серин в положении 4, и тирозин в положении 5, причем все эти остатки имеют реакционоспособные боковые цепи, которые могут стать синтетическими трудностями. Антагонисты ЛГ-РГ отличаются от ЛГ-РГ природного происхождения, как правило, делецией или замещением остатка гистицидина в положении 2. С точки зрения синтетической перспективы делеция гистидина снижает вероятность возникновения нежелательных побочных реакций, однако, присутствие серина и тирозина все же требует принятия специальных мер с целью устранения возникновения побочных цепных реакций. Аналоги ЛГ-РГ могут быть синтезированы различными методами, такими, как например, описанные ДжМ.Стюартом и Дж.Д.Янгом, Твердофазный Пептидный Синтез, Уи. Х. Фриман Ко. Сан-Франциско, 1969; Дж.Мейненхофером, Гормональные Белки и Пептиды, Том 2, стр.46, Академик Пресс (Нью-Йорк), 1973; и Е.Шредером и К.Любке, Пептиды, Том l", Академик Пресс (Нью-Йорк), 1965. Методы могут быть в широком смысле охарактеризованы либо как растворно-фазные, либо как твердо-фазные методики. Оба метода включают последовательное прибавление аминокислот в растущую пептидную цепь. Обычно, или амино-, или карбоксильную группу первой аминокислоты защищают посредством пригодной защитной группы. Защищенную аминокислоту затем можно либо присоединить к инертному твердому носителю либо использовать в растворе путем прибавления следующей защищенной аминокислоты в последовательности при условиях, пригодных для образования амидной связи. Защитную группу затем отщепляют от этого вновь прибавленного аминокислотного остатка, после чего осуществляют прибавление следующей аминокислтоы, и так далее. После того, как все требуемые аминокислоты присоединены в должной последовательности, любые оставшиеся защитные группы и любой твердый носитель удаляются с получением конечного полипептида. Путем простой модификации данной общей методики можно прибавить более одной аминокислоты за одно время в растущую цепь, например, путем сочленения защищенного трипептида с защищенным дипептидом, что позволяет получить пентапептид. Более строгие условия твердофазного синтеза обычно требуют, чтобы любые реакционноспособные боковые цепи на аминокислотах были защищены во время образования амидной связи. Защитные группы боковой цепи обычно отщепляют в отдельной стадии после отщепления образованного полипептида от инертного носителя, или совместно с этим отщеплением. Один особенно пригодный метод твердофазного синтеза с целью получения аналогов ЛГ-РГ описан в патенте США N 4234571 (Нестор и др.), раскрытие которого введено в данное описание в качестве отсылки. При таком общем подходе функцию -амино (N ) каждой аминокислоты защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию, такой, как трет-бутилоксикарбонил (Вос); любые реакционноспособные боковые цепи, как например, присутствующие на серине, гистидине и тирозине, также защищают сильно связанными группами, которые требуют обработки фторoводородом (HF) или подобных радикальных методик, для их отщепления. Кроме того, отщепление -аминозащитных групп и защитных групп в боковой цепи обычно осуществляют в отдельной стадии. Данный подход является достаточным для получения исследовательских количеств пептидов, однако при крупномасштабном производстве пептидов эти методы являются недостаточными. Аминокислоты с полностью защищенными боковыми цепями являются дорогостоящими, а такие расходы могут стать существенным фактором при коммерческом производстве пептидов. Кроме того, использование фтороводорода, не говоря уже об отравлении окружающей среды, приводит к коммерчески неприемлемым потерям в выходе продукта. И что более важно, вследствие использования отдельной производственной стадии для отщепления защитных групп боковой цепи синтетический процесс требует дополнительного времени и стоимости. Альтернативные способы не более привлекательны. Тиен и др. Pept. Chem. 375-379, Т, Шиба и С.Сакакибара (Ред.), Организация по Исследованию Белков, Осака (1088), изложили синтез ЛГ-РГ с использованием тозил-защиты относительно гистидина и бензил-защиты относительно тирозина и серина. Данный подход устраняющий необходимость использования фтороводорода, все же предполагает наличие отдельной стадии дегидрирования с целью отщепления бензил-защитных групп; при этом происходит некоторое восстановление триптофана. Кой Д.Х. и др. Int. I. Peptide Protein Res. 14, 339-343 (1979), приводят синтез антагонистов ЛГ-РГ, (D-Phe 2 , D-Trp 3 , D-Jhe 6) ЛГ-РГ, с использованием целого ряда методов защиты боковой цепи, при этом все они предполагают освобождение HF от защиты; в результате чего обеспечивается бензил-защита боковой цепи только серина, тозил-защита боковой цепи только аргинина, защита боковой цепи серина и аргинина, а также защита боковой цепи серина, аргинина и тирозина (с 2-бромбензил-оксикарбонилом). Солевая защита аргинина (в виде Arg HCl) также используется в синтезе "только серина". Фтороводород используют для отщепления неочищенного пептида от его носителя, а также для отщепления защитных групп боковой цепи. Только когда пептид "полностью" незащищен (и только солевая защита относительно аргинина), тогда только авторы патента могут избежать фторидной обработки. Все виды синтеза с защитой приводят к плохим результатам по сравнению с синтезом с незащищенной боковой цепью. Кой и др. далее приводят синтез агониста ЛГ-РГ: этиламида (D-Leu 6 , дес Gly-NH 2 10)-ЛГ-РГ, с использованием защиты боковой цепи динитрофенилом относительно только гистидина, солевой защиты аргинина, но без обработки HF. Динитрофенильную защитную группу боковой цепи отщепляют во время отщепления пептида от его носителя с помощью раствора этиламина в диметилформамиде. Выход в результате синтеза с защитой только гистидина составляет лишь 34% по сравнению с выходом в результате синтеза с полной защитой и обработкой HF. Отсутствует сравнение с незащищенным синтезом. Известные технические решения предполагают, что среди различных стратегий минимальной защиты защита только гистидина может привести к повышению выхода по сравнению с синтезом на основе полной защиты в отношении некоторых антагонистов ЛГ-РГ, однако никакой определенной выгоды нельзя извлечь в результате рассмотрения приведенных подходов к защите боковой цепи в отношении агонистов ЛГ-РГ. Тем временем, как идеальный подход к устранению стадии освобождения от защиты HF можно осуществлять в отношении незащищенного синтеза, отсутствие защиты для гистидина приводит к избыточной рацемизации. В соответствии с доктриной Коя и др. заявитель, однако, обнаружил, что использование защиты только гистидина также приводит к получению высоких уровней примеси бис-серина, вследствие ацилирования остатка серина. С целью достижения синтеза с минимальной защитой в отношении аналогов ЛГ-РГ без проведения стадии освобождения от защиты необходимо значительное усовершенствование по сравнению с известными техническими решениями, которое может также обеспечить защиту для тех групп, которые, когда незащищены, оказывают отрицательное влияние на чистоту и выход пептида. Целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, в котором защищены боковые цепи только минимального числа аминокислотных остатков. Другой целью изобретения является создание способа синтеза аналогов ЛГ-РГ, который устраняет необходимость освобождения от защиты HF, а также необходимость использования токсичного HF-реагента, уменьшая токсичный отработанный поток, часто встречающийся в традиционных способах. Упомянутые аспекты изобретения создают дополнительные преимущества, заключающиеся в снижении стоимости получения соединений лГ-РГ, а также в устранении дополнительной стадии отщепления защитных групп боковой цепи. Цели изобретения достигаются в отношении аналогов ЛГ-РГ с использованием способа временной минимальной защиты, при которой только гидроксильная боковая цепь аминокислотного остатка защищена группой, которую отщепляют сразу же после связывания серина с пептидной цепью. Защитная группа боковой цепи является группой, лабильной при тех же условиях, которые пригодны для отщепления -амино защитных групп. Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые содержат остаток гистидина, боковую цепь имидазола также можно защитить группой, лабильной в течение цикла связывания, преимущественно, лабильной для агента разблокировки -аминогруппы, однако, по выбору, она может быть защищена группой, отщепляемой аминозилом или аммонолизом. Временная защита боковой цепи серина и защита боковой цепи гистидина, если только имеется в наличии, минимизирует образование примесей и максимизирует выход продукта без необходимости в стадии освобождения от защиты HF. Способ временной минимальной защиты в соответствии с изобретением приемлем для твердофазного синтеза любого сериносодержащего полипептида, имеющего от нескольких до множества остатков, не взирая на остальную часть последовательности. Аналоги ЛГ-РГ, а также другие нона- и декапептиды являются предпочтительными синтетическими мишенями. Несмотря на то, что изобретение описано с учетом последовательного прибавления отдельных аминокислот, специалист в данной области техники поймет, что способ в равной мере приемлем для синтеза, в котором блоки меньших полипептидов связывают с образованием более крупных полипептидов, например, путем прибавления тетрапептида к пентапептиду, при условии, что боковая цепь остатков серина временно защищена в течение цикла связывания серина. Временная защита означает, что боковая цепь серина защищена в течение относительно короткого периода синтетического цикла. Защитная группа боковой цепи и -амино и карбоксильная защитная группа отщепляются одновременно после осуществления связывания серина. Как правило, решающим критерием отбора защитной группы боковой цепи серина является тот факт, чтобы группа была устойчивой к условиям связывания, однако лабильной к условиям освобождения от защиты -аминогруппы. В одном варианте настоящего изобретения с использованием -аминозащиты боковую цепь серина предпочтительно защищают группой, выбранной из трет-бутила, трет-бутилдиметилсилила, триметилсилила, тритила, пивалила и тетрагидропиран-2-ила. Для тех аналогов ЛГ-РГ, которые имеют остатки гистидина, как правило, желательно защищать боковую цепь имидазола. Эта защита также может иметь разновидность временной, то есть лабильной во время цикла связывания, или может оставаться на месте до тех пор, пока пептид не будет отщеплен от своего носителя. Предпочтительно, аминолиз или аммонолиз используют для отщепления полимера от своего носителя, и одновременно отщепляют защитную группу для гистидина. В другом варианте изобретения агент разблокировки выбирают из растворов хлористого водорода в С 3 -С 6 -спиртах и дихлорметане. Предпочтительно, отношение спирта к дихлорметану составляет от 0,1 до 10,0 (об.), а концентрация кислоты составляет от 2 до 9 н. Наиболее предпочтительно, спиртом является изопропанол. Сокращения и Определения Для изобретения выражение "ЛГ-РГ" относится к гормону, высвобождаемому лютеинизирующий гормон, и "аналоги Лг-РГ" подразумевают сам ЛГ-РГ, а также другие полипептиды, которые структурно связаны с ЛГ-РГ или происходят от него, и которые проявляют биологическую активность, аналогичную активности ЛГ-РГ. Сокращения для различных традиционных аминокислот рекомендованы Комиссией по Биохимической Номенклатуре Международного союза теоретической и прикладной химии Международного биохимического союза (ИЮПАК-МБС), Биохимия, 11, 1726 (1972). Все упоминаемые здесь пептидные последовательности написаны в соответствии с общепринятой конвенцией, где N концевая аминокислота находится слева и С-концевая аминокислота находится справа. Сокращения, приводимые здесь, представляют L-аминокислоты, за исключением ахирального аминокислотного глицина, и за другим исключением любой ненатуральной аминокислоты, которая является ахиральной, или же аминокислоты обозначены как D- или D, L-. Et обозначает этил. Bu обозначает бутил и iPr обозначают изопропил. Другие сокращения, пригодные при описании изобретения, включают замещения аминокислот в натуральном пептиде ЛГ-РГ следующими аминокислотными остатками: Аминокислотный Сокращение остаток 3-(2-нафтил)аланил Nal (2) 3-(п-фторфенил)аланил р-F-Phe 3-(п-хлорфенил)аланил р-Cl-Phe 3-(3-пиридил)аланил Pal (3) N G ,N G" -бис(этил)гомо- аргинил hArg (Et) 2 N G ,N G" -бис(2,2,2- трифторэтил)гомо- аргинил hArg (CH 2 CF 3) 2 N G -бутил-гомоаргинил hArg (Bu) N E -Изопропил-лизил Lys (iPr) (бензил)гистидил His (Bzl) Термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к солям, которые сохраняют требуемую биологическую активность родственного соединения без побочных токсикологических эффектов. Примерами таких солей являются кислые аддитивные соли, образованные неорганическими кислотами, например, хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и так далее; и соли, образованные органическими кислотами, такими, как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфокислота, нафталиндисульфокислота, полигалактуроновая кислота и так далее. Сокращение "N-Ac" относится конкретно к N-ацетил-защитной группе, то есть, ацетильной группе, присоединенной к концевому аминокислотному осстатку на аминном азоте, в соответствии с общепринятой номенклатурой. Предпочтительные варианты В одном варианте осуществления изобретения предлагается усовершенствованный способ минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения, имеющего аминокислотную последовательность формулы: R 1 -R 2 -R 3 -Ser-Tyr-R 4 -Leu-R 5 -Rro-R 6 (1) где R 1 выбирают из (пиро) Glu и N-Ac-D-Nal (2); R 2 выбирают из His. D-p-Cl-Phe и D-p-F-Phe; R 3 выбирают из Trp. D-Trp. R 4 выбирают из D-Nal- (2), D-hArg (Et) 2 . D-hArg (Bu), D-hArg (CH 2 CF 3) 2 . R 5 выбирают из Arg, L-hArg (Et) 2 , D-hArg (Bu), D-hArg- (CH 2 CF 3) 2 . R 6 выбирают из Cly-NH 2 , D-Ala-NH 2 , причем аминокислоты обеспечены N -защитой, отличающийся тем, что осуществляют (а) временную защиту боковой цепи серина в положении 4, пригодно, с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления -аминозащитных групп, без проведения рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от его полимерного носителя, и (b) защиту боковой цепи гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к агенту разблокировки -аминогруппы или к аминолизу или аммонолизу. В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ временной минимальной защиты для твердофазного синтеза соединения формулы (l), в котором (а) защищают -аминогруппы аминокислот в полипептиде, (b) защищают боковую цепь серина с помощью группы, лабильной к тем агентам, которые пригодны для отщепления -аминозащитной группой, (с) защищают боковую цепь гистидина, если присутствует, с помощью группы, лабильной к основным агентам разблокировки или группе отщепляемой аминолизом или аммонолизом, (d) привязывают С-концевую аминокислоту к инертному твердому носителю, (е) последовательно связывают, с помощью пригодного связующего средства, одну или более отобранных аминокислот одна с другой в последовательных циклах, начиная с С-конца, (f) отщепляют, к концу каждого цикла, защитные группы путем обработки агентом разблокировки, причем указанный агент разблокировки выбирают из агентов, способных отщеплять как -аминозащитную группу, так и защитную группу боковой цепи, без рацемизации, побочных реакций или отщепления растущего пептида от полимера, (g) повторяют стадии связывания и отщепления с образованием нона- и декапептида, (h) отщепляют полипептид от носителя аминолизом или аммонолизом и (i) выделяют и очищают полученный полипептид. В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ твердофазного синтеза соединения формулы l, в котором (а) связывают твердофазным синтезом соответствующий Вос-защищенный и трет-бутил-защищенный серин в последовательных циклах и в порядке справа налево относительно аминокислотной последовательности соединения формулы l, начиная с Вос-R6-O-, ковалентно связанного с инертным твердым носителем, (b) отщепляют, в начале каждого цикла, Вос-защитную группу и одновременно трет-бутиловую группу от серина или D-серина путем обработки агентом разблокировки, выбранным из HCl/CH 2 Cl 2 HCl (низший алканоил) СH 2 Cl 2 , с образованием полипептидной связи с ука- занным твердым носителем, (с) отщепляют полипептид от носителя аммонолизом и (d) выделяют полученный полипептид. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагается способ, описанный выше, для получения полипептида, имеющего приведенную выше формулу, где R 1 обозначает (пиро) Glu или N-Ac-D-Nal (2); R 2 обозначает His или D-p-Cl-Phe; R 3 обозначает Trp; R 4 обозначает D-Nal (2), D-hArg (Et) 2 ; R 5 обозначает Arg или L-hArg (Et) 2 и R 6 обозначает Gly-NH 2 , или D-Ala-NH 2 . В предпочтительном варианте осуществления изобретения функцию -амино (N ) аминокислот защищают группой, чувствительной к кислоте или основанию. Защитная группа устойчива к условиям образования пептидной связи, хотя легко отщепляется без разрушения растущей пептидной цепи или рацемизизации любого из хиральных центров, содержащихся в ней. Пригодными защитными группами являются трет-бутоксикарбонил (Вос), бифенилизопропилоксикарбонил, трет-амилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, -диметил, 3,5-диметоксибензилоксикарбонил, о-нитрофенилсульфенил, 2-циано-трет-бутилоксикарбонил, 9-фторэнилметилоксикарбонил (Fmoc) и так далее. Предпочтительно -аминозащитной группой является трет-бутоксикарбонил (Вос). Когда желательно получить пептид такой, как бусерелин или госерелин, в котором R 4 в Формуле (1) выше обозначает D-Ser (трет-Bu), Fmoc является предпочтительным для N -защиты в циклах связывания, включающих и следующих за прибавлением D-Ser (tBu). Fmoc является лабильным и к основным реагентам (рН 8,5), таким как пиперидин, который не отщепляет tBu от D-Ser (tBu). В последних циклах после прибавления D-Ser (tBu) необходимо использовать чувствительную к основанию N -защиту. Боковую цепь серина в положении 4 защищают группой, которая может быть отщеплена, например, мягкой фторидной обработкой. Предпочтительной защитной группой боковой цепи серина является трет-бутилдиметилсилил. Гидроксильную боковую цепь остатка серина защищают во время связывания серина с растущим пептидом, как описано для общего варианта настоящего изобретения. Защитную группу боковой цепи отщепляют после связывания и перед прибавлением следующей аминокислоты. Защитную группу боковой цепи серина отщепляют тем же реагентом, который используют для отщепления N -защитной группы. Предпочтительными защитными группами боковой цепи серина являются трет-бутил, трет-бутилдиметилсилил, триметилсилил, тритил, пивалил и тетрагидропиран-2-ил. Кроме того, также защищают имидазоловую боковую цепь гистидина, обычно присутствующего в агониcтах ЛГ-РГ. Защитная группа боковой цепи гистидина может быть также лабильной во время цикла связывания, например, лабильной к агенту разблокировки N -группы, однако, необязательно, ее отщепление может быть осуществлено, когда пептид отщеплен от его носителя. Предпочтительными защитными группами боковой цепи для гистидина являются п-толуолсульфонил и 2,4-динитрофенил. Для инициации синтеза первую аминокислоту, которой, как правило, является С-концевая аминокислота в конечном продукте, присоединяют к пригодному твердому носителю. Пригодными твердыми носителями в вышеуказанном синтезе являются те материалы, которые инертны к реагентам и реакционным условиям ступенчатых реакций конденсации-разблокировки, а также нерастворимы в используемых средах. Примерами коммерчески приемлемых полимеров являются стирол/дивинилбензоловые полимеры, модифицированные реакционноспособной группой, например хлорметилированный стирол-дивинилбензоловый сополимер, гидроксиметилированный стирол/дивинилбензоловый сополимер и так далее. Пpедпочтительным является полимер Merrifield (1% сшитый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола). Присоединение к полимеру, например, хлорметилированному стирол-дивинилбензоловому полимеру, осуществляют при помощи взаимодействия N -защищеннoй С-концевой аминокислоты, особенно, N -Вос аминокислоты, в виде ее цезиевой, тетраметиламмониевой, триэтиламмониевой, 1,5-диазабицикло(5.4.0)ундец-5-еновой или аналогичной соли в этаноле, ацетонитриле, N,N-диметилформамиде (ДМФ) и так далее, особенно, цезиевой соли в ДМФ, с хлорметилированным полимером при повышенной температуре, например, около 40-60 о С, предпочтительно, около 50 о С, в течение периода времени около 12-72 часов, предпочтительно, около 48 часов. Связывание последующих защищенных аминокислот осуществляют хорошо известными методами, обычно в автоматизированном пептидном синтезаторе. Каждую защищенную аминокислоту интродуцируют приблизительно при 1,5-2,5-кратном молярном избытке, и связывание осуществляют в инертном, неводном, полярном растворителе, таком как дихлорметан, ДМФ или их смеси, предпочтительно, в дихлорметане, при температуре почти комнатной. Связующий агент выбирают из N, N"-дициклогексилкарбодимида (ДЦК), N,N"-ди-изо-пропилкарбодиимида (ДИК) или другого карбодиимида, либо в отдельности, либо в присутствии 1-гидроксибензотриазола (HBt), О-ацилмочевин, бензотриазол--ил-окси-трис(пирролидино фосфоний) гексафторфосфата (РуВор), N-гидроксисукцинимида, других N-гидроксиимидов или оксимов. Альтернативно, могут быть использованы активные сложные эфиры защищенных аминокислот (например, п-нитрофенил, пентафторфенил и тому подобное) или симметрические ангидриды. Пептидный полимер проверяют на полное связывание с использованием Теста Кайзера (Anal. Biochem. 34, 595 (1970) за исключением того, что в случае связывания с пролином используют Тест Хлоранила (Anal. Biochem. 117, 145 (1981)) или Тест Изатина (Anal. Chim. 118, 149 (1980)). Если тест (ы) на полноту показывают, что реакция не завершена, связывание повторяют с использованием дополнительной аминокислоты, однако, опуская разблокировку дополнительной кислоты. Когда последнее связывание завершено, полимер промывают метанолом или метанолом, содержащим дихлорметан, и сушат при максимальной температуре 60 о С. В конце каждого цикла, то есть, после каждого прибавления следующей N -защищенной аминокислоты в растущую полипептидную цепь, защитную группу отщепляют путем обработки агентом разблокировки. При добавлении серина агент разблокировки удаляет как N -Вос-защитную группу, так и серин-защитную группу. Среди предпочтительных агентов разблокировки следует упомянуть хлорoводород в дихлорметане (HCl/-CH 2 Cl 2), трифторуксусную кислоту в дихлорметане (ТФК/СH 2 Cl 2) и хлороводород, растворенный в С 3 -С 6 -спирте, предпочтительно, изопропаноле, смешанном с дихлорметаном. как правило, концентрация HCl составляет от 2 н. до 9 н. предпочтительно от 4 н. до 5 н. Отношение CH 2 Cl 2 к С 3 -С 6 -спирту составляет 0,1-10 (объемн.); предпочтительно, около 1:1. Особенно предпочтительным агентом разблокировки является 4,5 н. раствор HCl в i-PrOH: CH 2 Cl 2 (1:1). Стадия разблокировки обычно имеет место при температурах от 0 до 45 о С, предпочтительно при температурах окружающей среды (от 20 до 27 о С). Специалист в данной области техники поймет, что отбор протокола связывания/разблокировки с использованием агентов иных, нежели, описаны выше, является правильным при условии, что остаток серина освобожден от защиты с помощью агента, который отвечает целям изобретения. Можно использовать методику с применением HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2 для каждого цикла освобождения от защиты. Альтернативно, также приемлем смешанный метод, в котором ТФК/CH 2 Cl 2 используют для определенных циклов, а HCl/iPrOH/CH 2 Cl 2 для других. Специалисту станут понятны и другие циклы. В конце твердофазного синтеза полипептид отщепляют от полимерного носителя. Отщепление проводят с помощью аммонолиза насыщенным раствором аммиака в пригодном растворителе для пептидов с С-концом аланина или глицина; для пептидов, имеющих С-конец пролина, отщепление осуществляют при помощи аминолиза алкиламином или фторалкиламино. Отщепление проводят при температуре приблизительно от 10 до 50 о С, предпочтительно, около 25 о С, в течение периода времени около 12-24 ч, предпочтительно, около 18 ч. Пригодные растворители включают метанол, этанол, изопропанол, диметилформамид, тетрагидрофуран, N,N-диметилэтаноламин, гексаны и их смеси. Предпочтительно, используют насыщенный раствор аммиака в метаноле. Альтернативно, пептид может быть отщеплен от полимера путем трансэстерификации основанием с последующим аминолизом. Затем полипептид очищают с использованием последовательности хроматографических стадий, применяя любой или все следующие типы: ионообменная хроматография на слегка основной смоле в ацетатной форме; гидрофобная абсорбционная хроматография или недериватизированная полистирол-дивинил-бензоловая (например, Amberlite XAD) хроматография; абсорбционная хроматография на силикагеле; ионообменная хроматография на карбоксиметилцеллюлозе; распределительная хроматография (например, на Sephadex G-25) или противоточное распределение; жидкостная хроматография высокого разрешения (ЖХВР), особенно, обращеннофазная ЖХВР на колонке с октил- или октадецилсилил-кремнеземом. Если рацемическую аминокислоту используют в одном или более положениях 1, 2, 3 или 6, и отдельные изомерные продукты представляют интерес, диастереомерные нонапептидные или декапептидные конечные продукты подвергают разделению после чего искомый полипептид, содержащий D-аминокислоту в соответствующем положении, выделяют и очищают, предпочтительно, во время осуществления вышеописанной хроматографической методики. Выделенный и очищенный полипептид, необязательно, превращают в фармацевтически приемлемую соль. Следующие примеры сравнивают способ временной защиты настоящего изобретения с незащищенным способом как для агониста ЛГ-КРГ, так и для антагониста ЛГ-РГ. Эти примеры представлены для целей только лишь специфичности и не должны ограничивать объем заявленного изобретения. В обоих продуктах примеров 1 и 3, использующих способ минимальной защиты изобретения, находится значительно меньшее количество примесей по сравнению с продуктами, полученными в примерах 2 и 4, использующих незащищенный синтез. Кроме меньшего числа примесей, способ настоящего изобретения отличается дополнительными преимуществами в смысле более высоких выходов продукта и использования менее опасных реагентов, в течение более короткого периода времени и с меньшими расходами энергии при выделении и очистке аналогов ЛГ-РГ. Дополнительным преимуществом является производство меньших количеств значительно менее токсичного отработанного потока. Получение А. Получение Вос-Gly-O-Полимера. 4,9 г N -Вос-глицина растворяют в смеси 50 мл метанола и 50 мл дистиллированной воды. рН раствора доводят до 7,5 водным бикарбонатом цезия. Затем растворитель удаляют в вакууме. Через 18 ч сушки под высоким вакуумом остаток растворяют в 150 мл сухого ДМФ. Прибавляют 25 г в 1% хлорметилированного полистирол/дивинилбензолового (Merrifield) полимера (соответствует 25 ммоль хлорида). Смесь встряхивают при 50 о С течение 24 ч, фильтруют и полимер промывают последовательно ДМФ, водой и этанолом. Полимер сушат в вакууме в течение 3 дней с получением 28,34 г Boc-Gly-О-Полимера. Получение В. Получение Вос-Ala-О-Полимера. В соответствии с методикой Получения A N -Boc-D-аланин прибавляют к 1% полимеру Merrifield с получением N -Boc-D-Ala-O-Полимера. П р и м е р 1. Синтез нафарелина с использованием минимальной защиты серина. В данном примере нафарелин получают с использованием следующего метода защиты боковой цепи: солевая защита относительно аргинина (в виде хлорида), тозиловая защита относительно гистидина и трет-бутиловая защита относительно серина. N -Вос-аминокиcлоты получают из Бачем (Торанс, Калифорния) (Leu, Tyr, His (Tos), Arg, Trp и Gly). Стар Биокемикал (Торранс, Калифорния) (Pro и Ser (tBu), Свинте Тех (Олбани, Орегон), (D-Nal (2). 4,0-4,5 н. растворы HCl в i-PrOH/CH 2 Cl 2 (1/1) получают барботажем HСl в холодный i-PrOH. После насыщения раствора (определено титрованием: приблизительно 9 н.) его сохраняют при комнатной температуре не более 3 дней и разбавляют равным объемом CH 2 Cl 2 перед использованием. 1,0 ммоль N -Boc-Gly-O-полимера из Получения А помещают в реактор автоматизированного твердофазного пептидного синтезатора Века 296 объемом 5,0 л, снабженного вспомогательными пробирками и колбами для прибавления реагентов и для создания повышенного давления, сбрасывания давления и поддержания инертной атмосферы азота. Следующие аминокислоты прибавляют к N -Boc-Gly-O-полимеру путем DIC или HBt содействующего DIC -связывания в течение 3 ч: N -Boc-Pro (2,0 экв,); N -Boc-Arg. HCl (2,0 экв.); N -Boc-Leu, H 2 O (2,0 экв.); N -Boc-D-Nal (2) (1-5 экв.)/HBt; N -Boc-Tyr (1,5 экв,)/HBt; N -Boc-Ser (tBu) (2,0 экв)/HBt; N -Bic-Trp (1,75 экв.)/-HBt; N -Boc-His (Tos) (1,75 экв.)/HBt; (пиро) Glu (2,5 экв.)/-HBt. Для отщепления N -защитной группы после каждого прибавления используют следующие методики. Программа А: полимер вначале промывают CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, ТФК СH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 1 мин, ТФК СH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 30 мин, CH 2 Cl 2 5 х 1 мин, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программа В: полимер вначале промывают CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н HCl в CH 2 CL 2 /i-PrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH 2 Cl 2 /i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Еt 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 x 1 мин, ДМФ 1 x 1 мин, СH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программу А используют для отщепления N -защитных групп на Gly, Pro, Arg, Leu, D-Nal (2) и Tyr. Программу В используют для отщепления N -защитных групп на Ser, Trp и His, а также для отщепления защитной группы боковой цепи серина. После осуществления каждой стадии освобождения от защиты и промывки в соответствии с Пpотоколом А или В, следующую аминокислоту в последовательности прибавляют к полипептидной цепи и полимер промывают CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. После построения последовательности пептид отщепляют от полимера путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле при температуре около 25 о С в течение 18 ч. Неочищенный пептид растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-Х4А (Био-Рад), после чего ацетат растворяют в минимальном количестве метанола, и прибавляют ацетон с целью преципитации пептида. Обращеннофазовую ЖХВР (Partisil ODS-3, 40 мкм, ацетонитрил с 0,5% уксусной кислотой) используют для удаления полярных и неполярных примесей. Фракции, содержащие по крайней мере 97% наферелин-ацетата, объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР и промывают 1% уксусной кислотой в воде. Остаток преципицируют, фильтруют, промывают и сушат под вакуумом. Аминокислотный анализ осуществляют на аминокислотном анализаторе Бекман 119СL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют 4 н. раствором CH 3 SO 3 H (0,2% -3-(2-аминометилиндол)HCl) в течение 20 часов при температуре 110 о С. Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием колонки ODS-11 из Олтех, 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыска, расход 1,5 мл/мин, 27,5% CH 3 CN, 72,5% 0,16 М КР 2 РО 4 , рН 5,1, температура 40 о С. ЖХВР анализ неочищенного пептида показывает основной пик с временем удерживания 18 мин в отношении нафарелина и отсутствие примесей в присутствии 1% при величине времени удерживания 14 мин. П р и м е р 2. Синтез нафарелина без защиты серина. Повторяют методику примера 1 за исключением того, что вместо N -Boc-Ser (tBu) используют N -Boc-Ser. ЖХВР -анализ показывает основной пик со временем удерживания 18 минут в отношении нафарелина, а также от 8,1 до 11,5% примеси при времени удерживания (ву) 14 мин. Кроме того, выход в результате этого "незащищенного" синтеза приблизительно равен выходу в результате полностью защищенного синтеза с использованием обработки фтороводородом; в последнем случае выход продукта значительно ниже того, который достигнут в результате синтеза с временной защитой Примера 1. П р и м е р 3. Синтез антагонистов ЛГ-РГ с использованием временной защиты серина. В данном примере антагонисты ЛГ-РГ, N-Ac-D-Nal (2) D-pCl-Phe-Pal (3) Ser-Tyr-D-hArg (Et 2) Leu-hArg (Et 2) Prp-D-Ala NH 2 , получают с использованием следующего протокола защиты боковой цепи: солевая защита относительно L- и D-hArg (Et 2) (в качестве хлорида) и трет-бутиловая защита серина. N -Вос-аминокислоты получают из Бачем (Торранс, Калифорния))D-Ala, Arg и Leu); Стар Биокемикалз (Торранс, Калифорния), (Pro); Синте Тех (Олбани, Орген) (D-Nal (2)), Инцель (Милуоки, Висконсин) (D-Pal (3)) и UCB Бaйопродактс (Бельгия) (p-Cl-Phe). Аминокислоты прибавляют к Na -Boc-D-Ala-полимеру Получения В в следующей последовательности: N -Boc-Pro (2,3 экв.); Na -Boc-hAtg (Et) 2 . HCl (1 экв.)/HBt; Na -Boc-Leu, H 2 O (2,3 экв.); Na -Boc-D-hArg (Et) 2 . HCl (1,6 экв.)/-HBt; Na -Boc-Tyr (2,1 экв.)/HBt; Na -Boc-Ser (tBu) (2,0 экв.); Na -Boc-D-Pal (3) (1,8 экв.)/HBt; Na -Boc-D-p-Cl-Phe (2,0 экв.); Na -Boc-D-Nal (2) (2,1 экв)/HBt; уксусный ангидрид. Ацетилирование осуществляют после Ala, Pro и Leu. Избыток HBt (2 экв.), используют для связывания основных аминоокислот, hArg (Ey) 2 и Pal (3). Аминокислоты присоединяют путем DIC или HBt опосредованного DIC -связывания в течение 3 часов, и полимер последовательно промывают CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин и СН 2 Сl 2 4 х 1 мин. Следующий протокол используют для отщепления N -защитной группы после каждого прибавления аминокислот. Программа А: полимер вначале промывают с помощью CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, ТФК CH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 1 мин, ТФК CH 2 Cl 2 (40/60) 1 х 30 мин, CH 2 Cl 2 5 х 1 мин, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программа B: полимер вначале промывают с помощью CH 2 Cl 2 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH 2 Cl 2 /-iPrOH (1/1) 1 х 1 мин, 4,0-4,5 н. HCl в CH 2 Cl 2 /i-PrOH (1/1) 1 х 30 мин, СH 2 Cl 2 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, Et 3 N CH 2 Cl 2 (5/95) 3 х 1 мин, ДМФ 1 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. Программу А используют для отщепления защитных групп на Ala. Pro, D-hArg (Et) 2 , Leu и D-Nal (2), Программу В используют для отщепления защитных групп на D-hArg (Et) 2 , Tyr, Ser, D-Pal (3) и p-Cl-Phe. После каждого освобождения от защиты и промывки, в соответствии с протоколом А или В, прибавляют следующую аминокислоту в последовательности и полимер промывают с помощью CH 2 Cl 2 3 х 1 мин, MeOH 4 х 1 мин, ДМФ 2 х 1 мин, CH 2 Cl 2 4 х 1 мин. После завершения cоставления последовательности пептид отщепляют от полимерного носителя путем обработки насыщенным раствором аммиака в метаноле в течение приблизительно 18 ч при температуре около 25 о С. Неочищенный пептид вначале растворяют в 2М уксусной кислоте и превращают в его ацетатную соль, пропуская через колонку смолы AG3-X4A (Био-Рад). Ацетат подвергают хроматографии на колонке силикагеля (CH 2 Cl 2 /i-PrOH/MeOH/H 2 O/HOAc в качестве растворителя); ацетатные фракции растворяют в воде и загружают на обращеннофазную колонку (Vydec c-18, 15-20 мкм) и очищают с использованием ацетонитрила/ТЕАР (рН 3,0). Фракции желательной степени чистоты объединяют и разбавляют водой, после чего перегружают на колонку обращеннофазовой ЖХВР, затем промывают 1% уксусной кислотой в воде. Пептид десорбируют смесью MeOH/CH 3 CN/HOAc/H 2 O (44/50/1/5). Остаток растворяют в метаноле или уксусной кислоте и преципицируют в присутствии простого эфира, фильтруют, промывают простым эфиром и сушат в вакууме. Аминокислотный анализ осуществляют на анализаторе аминокислотном Бекман 119CL. Пробы для аминокислотного анализа гидролизуют с помощью 6 н. раствора HCl при температуре 110 о С в течение 20 ч. Аналитическую ЖХВР осуществляют на хроматографе Спектра Физикс 8800 с использованием Spherisord C-8 (Олтех), 5 мкм, 4,6 х 250 мм, 10 мкл впрыск, расход 1,5 мл/мин, 30% СР 3 CN. 70% NH 4 H 2 PO 4 0,04 М, диметилоктиламин 4,3 х 10 -3 , температура 40 о С. Синтез антагониста подтверждают наличием основного пика при времени удерживания 18 мин; других пиков при 1% не обнаружено при времени удерживания 16 мин. П р и м е р 4. Синтез антагониста ЛГ-РГ без временной защиты серина
Повторяют пример 3 с использованием N -Boc-Ser вместо N -Boc-Ser (tBu). ЖХВР -анализ показывает присутствие основного пика при времени удерживания 18 мин относительно антагониста и присутствие примеси при концентрации 6,5% в отношении времени удержания 16 мин. Следующая формула изобретения раскрывает и заявляет предмет технического решения, которое заявитель считает своим изобретением. Приведенная формула изобретения нацелена на полный диапазон эквивалентных решений, признаваемых специалистами в данной области техники, относящейся к твердофазному пептидному синтезу.

Твердофазный синтез пептидов предложен Р. Б. Меррифилдом из университета Рокфеллера (Нобелевская премия 1984 г.). Этот метод основан на сборке пептида на нерастворимой полимерной подложке последовательным присоединением остатков аминокислот с защищенными α -амино- и боковыми группами. План состоял в том, чтобы собирать пептидную цепь постадийно, причем во время синтеза цепь должна быть одним концом привязана к твердому носителю. В результате выделение и очистка промежуточных и целевых производных пептидов сводились просто к фильтрованию и тщательной промывке твердого полимера для удаления всех избыточных реагентов и побочных продуктов, остающихся в растворе.

Термин твердофазный (solid-phase) относится скорее к физическим характеристикам вещества на носителе, так как химическая реакция на полимерном носителе протекает в одной фазе — в растворе. В подходящем растворителе полимер набухает, превращаясь в мало вязкий, но сильно структурированный гель (сшитые полимеры), или же растворяется (в случае не сшитых полимеров), и процесс синтеза происходит на ультрамикрогетерогенном уровне, в практически гомогенной системе.

Для твердофазного органического синтеза требуется полимерная основа — смола S , к которой прикреплен линкер L . На первой стадии к линкеру присоединяют молекулу субстрата А .Молекула А иммобилизуется (т.е. перестает быть мобильной), но сохраняет способность реагировать с другим реагентом В (стадия 2).

Продукт АВ остается на смоле, что позволяет отделить его от избытка реагента В (и побочных продуктов) простым промыванием. (Можно добавлять все новые реагенты, последовательно усложняя исходный субстрат А , главное чтобы линкер в этих реакциях оставался неизменным). Бифункциональный линкер L подбирается так, чтобы его связь со смолой S была более прочна, чем с субстратом А . Тогда на последней стадии целевое соединение AB можно отделить от смолы, разрушив его связь с линкером. Понятно, что связь L -AB должна расщепляться в мягких условиях, не повреждая ни само соединение (связь А -В ), ни контакт линкера со смолой (связь L -S ).

Таким образом, в идеальном случае, промывая смолу после каждой стадии и расщепляя связь с носителем, получают чистое вещество. Естественно полагать, что применение большого избытка реагентов и последующее отделение от смолы во многих случаях позволяют сдвигать химическое равновесие в сторону образования целевого продукта и сократить время синтеза. К недостаткам твердофазного органического синтеза можно отнести необходимость использования достаточно большого избытка (2—30 эквивалентов) реагентов, сложности при идентификации промежуточных продуктов синтеза, а также сравнительно высокую стоимость модифицированных полимерных носителей, которая определяется стоимостью линкера.

Введенный Меррифильдом в практику органического синтеза хлорметилированный полистирол (сшитый небольшим количеством дивинилбензола), так называемая смола Меррифильда, является самым доступным из полимерных носителей.

Методология и основные стадии твердофазного пептидного синтеза

Поставленная задача требует введения полимерного носителя с привитой аминокислотой в реакцию с активированным к замещению гетероциклом. Рассмотрим подробнее методологический аспект получения иммобилизированных аминокислот на полимерных носителях.

Стадия 1. Иммобилизация N-защищенной аминокислоты на полимерный носитель.

Первой стадией нашей схемы является иммобилизация аминокислоты на полимерный носитель. Для того чтобы избежать таких побочных процессов, как образование олигопептидов, аминокислоту предварительно защищают. Как правило, используют N-защищенные аминокислоты, и образующаяся связь между аминокислотой и носителем является связью амидного или сложноэфирного типа.

Наиболее часто применяемыми защитами аминогруппы в твердофазном органическом синтезе являются защитные группы карбаматного типа трет-бутоксикарбонильная (Boc) и 9H-флуоренилметоксикарбонильная защита (Fmoc), X — защищаемая группа:

Необходимо отметить, что выбор защитной группы определяется используемым типом полимерного носителя. Условия иммобилизации защищенных аминокислот различны для различных типов полимерных носителей. Иммобилизация Boc-аминокислот на смолу Меррифильда, представляющую собой хлорметилированный полистирол, проводится in situ в виде цезиевых солей при добавлении суспензии карбоната цезия в диметилфталате (DMF) и каталитических количеств йодида калия. Избыток реагентов по отношению к количеству носителя выбирается в каждом случае индивидуально и составляет 1,5—4 эквивалента.

Иммобилизация Fmoc-аминокислот на полимерный носитель Ванга (X=O) с образованием сложноэфирноголинкера бензильного типа осуществляется карбодиимидным методом при помощи диизопропилкарбодиимида (DIC) в присутствии 4-(диметиламино)пиридина (DMAP) в качестве катализатора. Реакция иммобилизации со стерически незатрудненными аминокислотами протекает при комнатной температуре. Иммобилизация стерически затрудненных аминокислот требует проведения реакции при 40—60 °С в течение 2-х дней и повторного проведения иммобилизации (схема 1).Иммобилизация Fmoc- аминокислот на полимерный носитель Ринка (X=NH) с образованием амидного линкера бензгидрильного типа осуществляется в присутствии реагента Кастро (1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)трис -(диметиламино)фосфония гексафторфосфата (BOP), основания диизопропилэтиламина (DIEA) и 1-гидроксибензотриазола (HOBt), в качестве катализатора. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 2 ч для стерически незатрудненных и 4—6 ч в случае стерически затрудненных аминокислот.

Стадия 2. Деблокирование защищенной аминокислоты на полимерном носителе

На второй планируемой нами стадии (после иммобилизации защищенной аминокислоты) требуется снять защитную группу для активации аминогруппы. Способы снятия Boc- и Fmoc-защиты различны. Удаление Boc-защиты аминокислот на смоле Меррифильда проводится 50%-ной трифторуксусной кислотой в дихлорметане в течение получаса, в этих условияхлинкер Меррифильда остается неповрежденным.

После снятия защиты смолу промывают раствором триэтиламина для удаления трифторуксусной кислоты. Удаление Fmoc-защиты аминокислот на носителях Ванга (X=O) и Ринка (X=NH) проводится 20%-ным раствором пиперидина в DMF течение 40—50 мин.

Значительное уменьшение массы смолы после снятия Fmoc-защиты может служить основой для гравиметрического определения степени иммобилизации защищенных аминокислот на первой стадии твердофазного синтеза. Рекомендуется проводить последовательную обработку смолы раствором пиперидина в диметилфталате— сначала в течение 5—10 мин, затем 30 мин в свежем растворе. После снятия защиты смолу промывают не менее 4-х раз диметилфталатом для отмывки от продуктов разрушения Fmoc-защиты. Контроль за протеканием реакции ацилирования на носителе или удаление защитной функции с аминогруппы возможен с помощью теста Кайзера.

Стадия 3. Нуклеофильное замещение в гетероциклах с участием иммобилизованной на носителе аминокислоты

Следующим этапом, запланированным нами для практической реализации, является проведение реакции ароматического нуклеофильного замещения; нуклеофилом служит привитая аминокислота, а активированный гетероцикл находится в растворе. Большинство реакций нуклеофильного замещения наносителях по выполнению не отличаются от реакций в жидкой фазе. Следует, однако, иметь ввиду, что температура процесса не должна превышать 120 С, выше которой начинает разрушаться полистирольная основа носителя. В условиях проводимой на носителе реакции линкер также должен сохраняться.

Выбирая подходящие активированные гетероциклические субстраты, следует учитывать природу уходящей группы в гетероцикле.

Стадия 4. Снятие целевого соединения с полимерных носителей

Большинство линкеров при твердофазном органическом синтезе расщепляются в кислой среде. Устойчивость линкеров к кислоте резко понижается при переходе от смолы Меррифильда к смоле Ванга и Ринка. Линкер Ринка расщепляется в более мягких условиях (10—20% CF3COOH), чем линкер Ванга (50% CF3COOH).Смола Меррифильда в этих условиях пассивна, и для ее расщепления используют переэтерификацию в растворе NaOMe/MeOH, приводящую к образованию эфира кислоты.

Еще раз напомним, что природа линкера определяет тип терминальной функции в образующейся молекуле, удаляемой с подложки. Смола Ванга позволяет получать кислоты, а смола Ринка — амиды.

Преимущества указанной схемы твердофазного пептидного синтеза:

1. Различные исходные соединения могут быть связаны с отдельными гранулами. Затем эти гранулы смешиваются и, таким образом, все исходные соединения могут взаимодействовать с реагентом в одном эксперименте. В результате продукты реакции образуются на отдельных гранулах. В большинстве случаев, смешивание исходных в традиционной жидкой химии приводит обычно к неудачам - полимеризации или осмолению продуктов. Эксперименты на твердой подложке исключают эти эффекты.

2. Поскольку исходные материалы и продукты связаны с твердой подложной, то избыток реагентов и не связанных с подложкой продуктов можно легко отмыть от полимерной твердой подложки.

3. Можно использовать большие избытки реагентов, для того чтобы провести реакцию до конца (больше, чем 99%), поскольку эти избытки легко отделяются.

4. В случае использования низких объемов загрузок (менее 0,8 ммоль на грамм подложки) можно исключить нежелательные побочные реакции.

5. Интермедиаты в реакционной смеси связаны с гранулами и их нет необходимости очищать.

6. Индивидуальные гранулы полимера могут быть разделены в конце эксперимента и таким образом получаются индивидуальные продукты.

7. Полимерная подложка может быть регенерирована в тех случаях, когда подобраны условия разрыва и выбраны соответствующие якорные группы - линкеры.

8. Возможна автоматизация твердофазного синтеза.

Необходимыми условиями проведения твердофазного синтеза, кроме наличия нерастворимой полимерной подложки, инертной в реакционных условиях, являются:

Присутствие якоря или линкера - химической функции, обеспечивающей связь подложки с наносимым соединением. Он должен быть ковалентно связан со смолой. Якорь также должен являться реакционно-способной функциональной группой для того, чтобы субстраты могли взаимодействовать с ним.

Связь, образующаяся между субстратом и линкером должна быть стабильна в условиях реакции.

Должны существовать способы разрыва связи продукта или интермедиата с линкером.

«Биолог. журн. Армении, 1 (65), 2013 ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ Г.С. ЧАИЛЯН Институт биохимии им. Бунятяна НАН РА...»

Экспериментальные и теоретические статьи

Experimental and theoretical articles

Биолог. журн. Армении, 1 (65), 2013

ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА,

ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ

Г.С. ЧАИЛЯН

Институт биохимии им. Бунятяна НАН РА

[email protected].

В целях продолжения исследований акад. Галояна, нами был проведен ряд экспериментов по выделению, очистке и определению биологической направленности нововыделенных соединений пептидной природы из предсердий и ушковых частей сердца свиньи. Для проведения биотестов требовалось получить препаративные количества исследуемых образцов. Для этого мы воспользовались методикой твердофазного синтеза пептидов с ее дальнейшей модификацией. Чистота и идентичность синтезированных препаратов проверялись методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрального анализа.

Твердофазный синтез – fmoc-аминокислоты – ВЭЖХ – фенилизотиоцианат – масс-спектральный анализ:

fmoc- – – For further studies established by Galoyan, a series of experiments on the isolation, purification and determination of biological direction of peptides isolated from pigs atria were carried out. For fulfilling the biotests the preparative amount of samples was required. A modified method of solid phase peptide synthesis was used. The synthesized peptide purity and identity were defined by HPLC and mass-spectral analysis.

Solid phase synthesis – high performance liquid chromatography – mass spectrometry – fmoc-aminoacids – cardiopeptides – atria В течение многих лет в Институте биохимии НАН РА в отделе биохимии нейрогормонов акад. Галояном с сотрудниками изучались пути регуляции и механизмы действия гипоталамических нейрогормонов на различные процессы в организме .

Подтверждение идеи о взаимосвязанном, взаимообусловленном, цельном функционировании такой системы, как гипоталамус – гипофиз – надпочечники, явилось переломным моментом в эндокринологии. Пополнение же этой концепТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ туальной триады, выдвинутой Галояном относительно взаимодействия гипоталамус - гипофиз

– сердце, является огромным научным достижением. Впоследствии была обнаружена новая ткань-мишень-сердце, показана способность этого органа управлять функционированием специфических пептидов, а также существование механизма обратной связи между гипоталамусом и сердцем посредством этих пептидов.

Обнаружение кардиоактивных соединений – нейрогормона К, С, G и ряд других в гипоталамусе различных животных послужило началом работ не только по изучению молекулярных механизмов действия этих нейрогормонов, но и по поиску подобных соединений в сердце . Основанием для всестороннего исследования биохимических и физико-химических свойств кардиоактивных начал послужили данные о наличии 2-х кардиоактивных соединений в сердечной мышце . Было установлено участие нейрогормона “С” в регуляции гликолитических процессов и уровня циклических нуклеотидов посредством ингибирования ФДЭ цАМР, цАМФ- зависимой протеинкиназы и т.д. Было показано, что это соединение является низкомолекулярным и относится к гликопептидам .

Нами в лаборатории аналитической хроматографии и пептидного синтеза была проведена работа по выделению и очистке соединений пептидной природы из предсердий и ушковых зон сердца свиньи . При разделении пептидных фракций препаративной ВЭЖХ, нами были выделены и очищены до гомогенного состояния 20 соединений пептидной природы . Для определения биологической направленности все препараты были тестированы на изменения компонентов ЭКГ у крыс . Результаты экспериментов показали, что 7 соединений имеют разносторонние факторы влияния на определенные компоненты ЭКГ.

Пептид №7 показал наибольшую активность на изменение амплитуды компонента R, длительности комплекса QRS, амплитуды S и других параметров.

Для изучения биологических механизмов действия данного препарата стало необходимо наличие большого количества исследуемого образца. Ввиду того, что процесс выделения и очистки биопрепаратов является крайне неэффективным, трудоемким, времязатратным и не может обеспечивать хорошей воспроизводимости, стало крайне актуальным проведение химического синтеза данного препарата. Анализируя мировую литературу в области химического синтеза пептидов, мы пришли к выводу, что наиболее оптимальным для нас является методика твердофазного синтеза с использованием fmoc-защищенных аминокислот. Открытый в 1984 году твердофазный синтез пептидов (Solid phase peptide synthesis) имеет много преимуществ по сравнению с обычным синтезом с точки зрения эффективности, а также удобной обработки и очистки .

С использованием несколько различных методик: гидролиза данного препарата, модифицирования аминокислот фенилизотиоцианатом, нами был получен аминокислотный состав пептида №7. Используя данные масс-спектрального и ЯМР-анализов, эдмоновской деградации, нам удалось получить не только аминокислотный состав, но также аминокислотную последовательность пептида №7.

Phe – Val – Pro – Ala – Met – Gly – Ile – Arg – Pro Эффективный процесс твердофазного синтеза во многом зависит от правильного выбора различных условий его проведения, таких как выбор смолы, растворителя и кинетики проведения синтеза . Эти переменные влияют на степень набухания смолы и связи ее с аминокислотами, количеству связывающих сайтов, что в конечном итоге влияет на синтез пептида в целом. Мы приспособи-ли процесс твердофазного синтеза по отношению к нашим исследуемым пептидам с учетом особенностей их аминокислотной последовательности.

Г.С. ЧАИЛЯН Материал и методика. Все использованные реактивы, растворители, смолы фирмы “Advanced Chem Techcompany”. Мы использовали fmoc-группы для защиты N-концов аминокислот в процессе синтеза и диметилформамид (DMF) как растворитель в процессе всего синтеза. В качестве подложки мы использовали кислотолабильную 2-хлортритильную смолу. Снятие защитных fmoc-групп проводилось с помощью раствора пиперидина в DMF.

Очень важным в процессе синтеза является посадка первой аминокислоты на смолу. Два грамма 2Cl-Trt-й смолы насыпали в шприц объемом 10 мл. Набирали DMF в шприц, давали набухнуть смоле в течение 15 мин. После этого DMF вымывался. Затем в шприц набирался раствор первой аминокислоты (fmoc-Pro) и активатор реакции (DIPEA) в соотношении 1СМОЛА/1,2FMOC-PRO/4DIPEA. Реакция посадки первой аминокислоты шла 3 ч. Очень важным условием проведения синтеза является отсутствие свободных линкеров после посадки первой аминокислоты, поэтому смолу после связывания с первой аминокислотой обрабатывали смесью метилена, DIPEA (диизопроилэтиламин) и DMF в соотношении 80DMF/15MEOH/5DIPEA для блокирования возможно оставшихся свободных концов. После этого промывали смолу DMF 5 раз по 5 мин. Затем проводили деблокирование аминокислот 30%-ным раствором пипередина в DMF 8 раз по 5 мин. После этого смолу промывали DMF 5 раз по 5 мин. Этот цикл повторялся в течение всего синтеза пептида. После каждого шага присоединения и деблокирования аминокислот контроль хода реакции проверялся Кайзер тестом, что представляет собой реакцию нингидрина со свободной аминогруппой с образованием характерного темно-синего цвета. Благодаря этому тесту, стал возможным пошаговый контроль реакций посадки и деблокирования аминокислот.

Очистка и контроль синтезированного пептида № 7 были проведены на 2-х компонентной препаративной системе ВЭЖХ фирмы Waters (USA). Для ввода образца использовался инжектор Rheodyne с объемом петли 500 мкл. Детектирование проводилось в диапазоне 190-360 нм. Мы использовали колонку “Symmetry Si-100 C18” (4,6х250 mm) для обращенно-фазовой ВЭЖХ. Скорость потока была 50 мл/мин. Использовалась градиентная система элюента H2O/ACN/TFA (98/2/0.1) / (0.100.0.1). Время анализа 15 мин. Рехроматографию проводили на аналитической системе Knauer HPLC. Использовалась колонка XbridgeC18 (2.6x150 mm). Детектирование проводили при 214 нм.

Для подтверждения полученных данных синтезированный препарат был подвергнут массспектральному анализу на CSU "Analitycal spectrometry”.

Результаты и обсуждение. Данные, полученные на хроматограмме, позволяют утверждать, что чистота синтезированного пептида №7 после очистки составляет более 99,6% (pис.1).

–  –  –

Нами был проведен сравнительный хроматографический анализ нативного пептида №7 на колонке X-bridgeC18 в тех же условиях, что и его синтезированный аналог. Результаты сравнения представлены (pис. 2).

ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ КАРДИОАКТИВНОГО ПЕПТИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПРЕДСЕРДИЙ СВИНЬИ

–  –  –

Рис. 4. Спектрограммы синтезированного (А) и нативного (В) препаратов.

Г.С. ЧАИЛЯН Как видно из сравнения хроматограмм, синтезированный аналог и нативный пептид № 7 одинаковы по массе и времени выхода, что говорит об идентичности их структур и аминокислотной последовательности. Таким образом, используя метод твердофазного синтеза пептидов и учитывая особенности строения исследуемого пептида, нам удалось получить гомогенный и идентичный нативному пептид, состоящий из 9 аминокислот. В дальнейшем, имея достаточное количество препарата, мы планируем провести ряд биотестов по выявлению не только путей регуляции сердечной деятельности этим пептидом, но также механизмов действия на другие органы и системы.

ЛИТЕРАТУРА

Попова Т.В., Срапионян Р.М., Галоян А.А. Обнаружение и идентификация в сердце быка новых 1.

кардиоактивных белков. Вопр. мед. химии, 37, 2, с. 56-58, 1991.

Срапионян Р.М., Саакян С.А., Саакян Ф.М., Галоян А.А. Выделение и характеристика 2.

кардиоактивного триптического фрагмента белка-носителя нейрогормона “С”. Нейрохимия, 2, 3, с. 263-271, 1983.

Срапионян, Р.М. Мисирян, С.С. Разделение низкомолекулярных коронароактивных соединений 3.

сердечной мышцы сочетанием методов гелевой фильтрации и электрофореза в полиакриламидном геле. Биолог. журн. Армении, 27, 10, 102-104, 1974.

4. Срапионян, Р.М. Попова, Т.В. Галоян, А.А. Распределение кардиоактивных белковых комплексов в сердце различных животных. Биолог. журн. Армении, 40, 7, 588-590, 1987.

5. Galoyan A. The Regulation of Neurosecretion and Hormones of Hypothalamo-Neurohypophyseal System, USSR, 1963.

6. Galoyan A.A. Biochemistry of Novel Cardioactive Hormones and Immunomodulators of the Functional System Neurosecretory Hypothalamus, Endocrine Heart. Nauka Publ. p. 240, 1997.

7. Galoyan A.A., Besedovsky H. Handbook of Neurochemistry and molecular Neurobiology, 3rd edition, Springer Publishers, 500 p., 2008.

8. Galoyan A.A., Brain Neurosecretorycytokins: Immune Response and Neuronal Survival, VIII, 188 p., 2004.

9. Galoyan A.A., Srapionyan R.M. The purification of coronarodilatory proteins isolated from the hypothalamus. Dokl. Akad. NaukArm.SSR, 42, 4, p. 210-213, 1966.

10. March J.,Smith M. March’s advanced organic chemistry. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, p. 133, 2007.

–  –  –

Похожие работы:

« СООБЩЕСТВ ИЗДАТЕЛЬСТВО «НАУКА» Москва 1979 УДК 581.55:56.017 Плот н и к о·в В. В. Эволюция структуры растительных сообществ. М.: Наука, с. 1979, 276 На современной мет...»

«Известия Музейного Фонда им. А.А.Браунера №2 Том I 2004 Известия Музейного Фонда им. А. А. Браунера Том I № 2 2004 Научный журнал Основан в декабре 2003 г. Выходит 4 раза в год Свидетельство о государственной регистрации ОД № 913 от 13.12.2003 г. Учредитель и изда...»